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程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)是动植物中普遍存在的重要生物学现象,它是指细胞自主进行的受基因编码调控的自我降解和消亡的过程。高等植物的小孢子母细胞要发育成有功能的花粉,需要花药绒毡层细胞进行PCD,为花粉的发育提供蛋白质、脂类、孢粉素等营养物质。当绒毡层细胞不能进行正常的PCD时,会造成花粉败育,导致植物雄性不育。已有研究表明活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)参与了绒毡层PCD过程,当水稻花药中的ROS不能被清除时,会导致绒毡层PCD提前。研究ROS调控花药绒毡层PCD的分子机制,对揭示程序性细胞死亡的分子机理具有重要的研究价值,进而可以通过生物工程技术直接控制花药中ROS的含量创建雄性不育系,用于培育杂种优势植物。前人的研究表明DYT1、TDF1、AMS、MYB80等关键转录因子,级联调控拟南芥花药绒毡层PCD过程。这些转录因子分别发生功能缺失突变,都会导致植物雄性不育,如突变体dyt1、tdf1、ams的绒毡层PCD延迟,突变体myb80的绒毡层PCD提前。我们发现一个功能未知的基因RBOHE(Respiratory Burst Oxidase Homolog E),在拟南芥花药第6-11期高水平表达。RBOHE编码一个NADPH氧化酶,在动植物中功能已知的NADPH氧化酶可以氧化NADPH产生ROS,调控多种生物学过程。而过多的ROS会损伤DNA、蛋白质和质膜,引起程序性细胞死亡。我们通过对已公开发表的花药转录组学数据进行分析,发现RBOHE在绒毡层PCD延迟突变体dyt1、tdf1、ams中表达量显著降低,而在绒毡层PCD提前突变体myb80(ms188-1)中表达量明显升高。我们推测RBOHE基因很可能受DYT1、TDF1、AMS、MYB80等关键转录因子调控,在花药绒毡层细胞中时空特异性表达产生ROS调控绒毡PCD。本实验的主要结果和结论如下:(1)RBOHE基因在花药绒毡层细胞中时空特异性表达通过RNA原位杂交和启动子连接报告基因实验研究了RBOHE的表达模式,结果显示:随着花药的发育,RBOHE在花药绒毡层细胞中时空特异性表达,在花药第6-7期,RBOHE开始表达,并且表达量逐渐升高;在花药第8-9期,RBOHE的表达量达到峰值;在花药第10-11期,RBOHE的表达量逐渐降低,最终随着绒毡层细胞的降解而消失。这说明RBOHE确实在绒毡层中时空特异性表达。(2)RBOHE基因的功能缺失突变和过量表达都会干扰绒毡层PCD进程。通过反向遗传学对拟南芥rbohe基因的功能缺失突变体进行分析,结果显示:rbohe突变体果荚结实率较野生型下降约20%,rbohe突变体花粉败育率约为50%。花药树脂切片和透射电镜结果显示:rbohe突变体的花药绒毡层降解较野生型明显推迟。原位末端凋亡检测结果显示:rbohe突变体的花药绒毡层pcd起始时间较野生型亦明显推迟。在野生型拟南芥中,用花药绒毡层特异的启动子驱动过量表达rbohe,导致转基因植株花药绒毡层pcd提前,花粉败育。这说明rbohe基因在花药绒毡层细胞中的表达量需被严格控制,否则会影响绒毡层pcd进程和花粉发育。(3)rbohe和rbohc基因在绒毡层pcd过程中功能冗余通过rna原位杂交和启动子连接报告基因实验研究了rbohc的表达模式,结果显示:rbohc在花药绒毡层细胞中的表达时期与rbohe相似,但表达量显著低于rbohe。扫描电镜结果显示:rbohe/rbohc双突变体花粉败育率约60%,较rbohe单突变体显著升高。树脂切片和原位末端凋亡实验显示:rbohe/rbohc双突变体的绒毡层降解较rbohe单突变体亦明显推迟。这说明rbohe和rbohc基因在绒毡层降解过程中功能冗余,共同调控拟南芥花药绒毡层pcd进程和花粉发育。(4)nadph氧化酶通过产生ros调控绒毡层pcd进程通过nbt染色和h2dcf-da荧光染色实验检测拟南芥花药中ros的动态变化,结果显示:在野生型中,随着花药的发育,ros的量呈现动态变化,在花药第6-7期,ros的量开始升高,在花药第8-9期,ros的量达到峰值,在花药第10-11期,ros的量逐渐降低。ros在花药中的动态变化与rbohe和rbohc在花药中的表达模式相对应。并且在rbohe单突变体和rbohe/rbohc双突变体的花药中,ros的量较野生型明显降低,rbohe/rbohc双突变体中ros的量较rbohe单突变体亦明显降低。在过量表达rbohe的转基因植株中,ros的量在花药第6-7期出现峰值,到花药第8期,ros的量开始降低。这说明rbohe和rbohc通过产生ros调控绒毡层pcd进程。(5)rbohe基因分别受绒毡层中关键转录因子ams正调控和myb80负调控荧光定量pcr结果显示:在ams突变体的花药中,rbohe的表达量降低60倍;在ms188-1(myb80)突变体的花药中,rbohe的表达量升高到2.5倍。通过rna原位杂交和启动子连接报告基因实验分别检测rbohe在ams和ms188-1突变体中的表达量,结果显示:在ams突变体的绒毡层细胞中,几乎检测不到rbohe信号;在myb80突变体的绒毡层细胞中,则检测到较野生型中更强的RBOHE信号。通过构建rbohe/myb80双突变体并对其表型进行分析,结果显示:rbohe/myb80双突变体可以部分恢复myb80单突变体绒毡层PCD提前的表型。这说明RBOHE在绒毡层细胞中时空特异性表达受绒毡层PCD过程中的关键转录因子调控。综上所述,拟南芥RBOHE基因分别受转录因子AMS正调控和MYB80负调控,在绒毡层细胞中时空特异性表达产生ROS,调控绒毡层PCD进程和花粉发育。