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心力衰竭(Heart failure, HF)是一种由心肌结构和功能缺陷引起的临床综合征，以心室充盈受损和射血分数降低为突出临床表现。心力衰竭在全球发病率很高，目前全球约有2600万人患有心力衰竭，并且仍以每年200万的速度递增，严重危害着人类生命健康，医疗资源支出的不断增加也给各国带来了严重的经济负担，随着人口老龄化的不断加剧，心力衰竭将是继续在世界上占主导地位的一个医学问题。在心力衰竭的临床干预中，如何改善患者心脏功能、缓解临床症状、提高生存质量、延长寿命是心力衰竭患者治疗的关键目标。因此，进一步探讨心力衰竭的发病机制，寻找心力衰竭治疗的新靶点、新方向可以为临床心力衰竭治疗策略的深入研究提供有力的理论依据。
研究发现，在心力衰竭的发病机制中，神经-体液调节机制的过度激活、炎症介质的释放、凋亡、自噬等因素与之关系密切。自噬(autophagy)是近年兴起的关于心力衰竭发生机制研究的热点，是指由自噬相关基因调控的，溶酶体介导的依赖性降解细胞内成分的机制，这些成分被回收用于能源供应或其他目的，通过自噬可以清除衰老受损的细胞器，以维持细胞的稳定。经典的自噬过程包括双层膜吞噬体结构的形成以吞噬细胞器或胞质成分，进一步通过溶酶体融合而降解。
自噬体的形成是自噬发生的重要环节，这一环节与自噬相关基因Atg(Autophagy associated gene, Atg)家族的功能关系密切。其中酵母Atg-6同系物Beclin-1是Atg表达蛋白的一种，当Beclin-1等Atg家族的蛋白表达增加时，可通过调节其他Atg蛋白在自噬前体中的定位，调控自噬体的形成，促进自噬活性增加。酵母自噬相关基因Atg-8的同源基因自噬微管相关轻链蛋白(Microtuble-associated protein 1 light chain 3, LC-3)是自噬过程中必须的泛素样通路关键蛋白，参与自噬体的形成，是自噬溶酶体形成过程中不可或缺的重要分子。在自噬形成过程中，胞浆中水溶性LC3Ⅰ与磷脂酞乙醇胺发生反应生成脂溶性LC3Ⅱ，分布于自噬体膜上，LC3Ⅱ的升高可作为自噬启动的标志，LC3Ⅱ蛋白的含量或LC3Ⅱ/LC3I的比例均与自噬体的数量呈正相关，可以在一定程度上反应细胞自噬的活性。自噬降解底物P62通过LC3识别序列与LC3作用并将泛素化蛋白转运至自噬体，把被降解物在自噬溶酶体中降解，P62则伴随着聚合物的清除而排除，当细胞的自噬活性升高时，P62蛋白表达下降，表现为与自噬程度呈负相关。
成人心脏心肌细胞再生率低，导致心肌细胞更新能力有限。因此，细胞内物质的更新循环在稳定心肌细胞功能和寿命方面至关重要。研究表明，自噬在心力衰竭的病理生理学中起重要作用。无论是在生理状态下还是在病理状态下，心肌的自噬过程对于防止大分子聚集和功能失调的细胞器的积累，维持细胞内环境的稳定都是至关重要的。生理状态下，自噬现象存在于人体的心肌中，自噬参与调控心肌细胞功能和寿命；在心肌肥厚、缺血缺氧等病理状态下，机体通过调控自噬过程来减少外界因素损害。自噬过程对心脏的作用是双重性的，一方面是保护性作用，即当心脏受到外界刺激时，适度自噬激活可稳定心肌细胞，保护心肌细胞免受死亡。另一方面是损害性作用，过度激活的自噬会导致细胞器破坏，从而促进心肌细胞死亡。
自噬过程受到多种信号转导通路的调控，如PI3K/AKT、AMPK、Beclin1、ROS等。PI3K/AKT信号转导通路是自噬过程中经典的信号转导通路，该通道主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB, Akt)组成。PI3K和Akt的激活可通过调控一系列下游蛋白，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、糖原合酶激酶(GSK)-3β、叉头转录因子(FOXOs)和某些Bcl-2家族成员来维持或改善细胞存活和心功能。研究发现，调控PI3K/AKT信号通道可以有效调控心肌细胞自噬活性，影响心肌重构，这在心力衰竭的发生发展过程中发挥着积极的意义。因此，寻找临床可行的干预手段，对心肌细胞自噬进行适度的调控，调节心脏重构，改善心功能，是临床心力衰竭治疗中要关注和研究的热点之一。
心脏收缩力调节(cardiac contractility modulation，CCM)是在心肌细胞绝对不应期内给予高强度电刺激，这种刺激并不引起心肌细胞除极，但能够提高心肌的收缩力，从而改善心脏功能，在慢性心力衰竭治疗中发挥重要作用。既往基础研究表明，CCM治疗可以改善心肌组织胚胎型基因的异常表达，使肌浆网钙循环基因和牵张反应基因表达正常化，可以调节钙离子转运相关蛋白(如肌浆网钙ATP酶、受磷蛋白等)表达及功能，从而发挥增强心肌收缩力作用。临床研究显示，CCM后可以改善患者心力衰竭临床症状，提高运动耐量和生活质量，降低心力衰竭的住院率。
本研究中采用慢性心力衰竭动物模型(升主动脉缩窄法)，观察CCM对慢性心力衰竭兔心肌细胞自噬的影响，并进一步观察CCM后心肌组织中AKT、PI3K、FOXO3、mTOR、TORC2、GSK3β蛋白表达水平的改变，初步探讨CCM在自噬调控中的可能机制，以期为临床应用CCM进行心力衰竭治疗的研究提供理论依据。
第一部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织自噬的影响
目的：建立兔慢性心力衰竭模型，通过超声心动图和血BNP水平反应兔心衰程度，HE染色观察心肌组织形态，免疫荧光染色观察自噬相关蛋白LC3的表达情况，初步探讨心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能和自噬的影响。
方法：30只健康新西兰大白兔随机分为3组：假手术组(Sham group)、心力衰竭组(HF group)、CCM干预组(CCM group)各10只。假手术组开胸后，随即关闭胸腔，不进行升主动脉缩窄操作；心力衰竭组开胸，在距离升主动脉根部以远1cm处环扎升主动脉至原周长60%；CCM组主动脉缩窄手术同心力衰竭组，环扎后在左心室前壁缝入小儿临时起搏电极。术后12周后检测心功能，达到心力衰竭标准的动物进行后续实验。各组动物继续分笼饲养4周，CCM干预组自第12周起开始连续进行电刺激4周。
各组动物分别于术前，术后12周和术后16周测定超声心动图，观察左室射血分数、左室短轴缩短率、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径指标，了解心脏收缩功能及左室腔大小变化。取静脉血检测血中B型脑钠肽水平，对比各组兔心脏功能及心力衰竭指标的变化；各组兔术后16周空气栓塞处死，于左室前壁取材，HE染色观察心肌组织结构改变，免疫荧光染色观察自噬相关蛋白LC3的表达，初步探讨CCM对慢性心力衰竭兔心脏功能和自噬的影响。
结果：
1.动物模型建立情况
术后12周时心力衰竭组和CCM干预组实验动物心脏超声检查结果均满足EF＜40%的诊断标准，同时表现出进食、饮水减少，体重增长缓慢，反应迟钝，呼吸急促等心衰临床表现，提示心力衰竭模型建立成功。除术中死亡外，术后16周各组实验动物均有9只存活。
2.心脏超声检查结果
术前三组实验动物心脏超声各指标无明显差别(P＞0.05)，左室射血分数为67.32±3.62%，左室短轴缩短率为34.39±3.04%，左室收缩末期内径为9.07±0.57mm，左室舒张末期内径为11.31±0.26mm。与假手术组相比较，升主动脉缩窄术后12周时心力衰竭组和CCM干预组动物左室射血分数(38.22±1.99%)、左室短轴缩短率(19.58±1.82%)均下降(P＜0.05)，而左室收缩末期内径(12.13±0.52mm)和舒张末期内径(14.70±0.77mm)升高(P＜0.05)，达到实验动物心力衰竭诊断标准，动物模型成功建立经过CCM干预4周后动物左室射血分数(45.22±1.86%)、左室短轴缩短率(22.72±1.15%)比心力衰竭组明显升高(P＜0.05)，而左室收缩末期内径(10.01±0.28mm)和舒张末期内径(12.94±0.48mm)较心力衰竭组明显降低(P＜0.05)。提示CCM干预改善了心力衰竭兔的心脏功能。
3.静脉血中B型脑钠肽水平
假手术组静脉血中B型脑钠肽基础水平为29.79±2.81ng/ml，三个实验组相比较无显著差异(P＞0.05)。升主动脉缩窄或其sham手术后12周，心力衰竭组和CCM干预组实验动物静脉血中B型脑钠肽水平与假手术组相比均明显升高，分别为61.12±5.78ng/ml和63.78?4.96ng/ml(P＜0.05)，提示动物出现了明显的心力衰竭，模型成功建立。CCM干预组中，经过CCM干预4周后，动物静脉血中B型脑钠肽水平较心力衰竭组明显下降，为49.52±2.95ng/ml(P＜0.05)，提示CCM持续干预有效减轻了兔升主动脉缩窄导致的心力衰竭。
4.组织病理学检查(HE染色)
假手术组实验动物心肌组织细胞排列有序，胞核均一、核仁饱满，心肌细胞形态大小正常。心力衰竭组中，升主动脉缩窄术造成了动物心肌细胞的广泛损害，表现为细胞肥大水肿，心肌纤维排列紊乱、断裂，部分心肌纤维缺失，大量炎细胞浸润。与心力衰竭组相比较，CCM干预4周后心肌组织的病理学损伤得到明显改善，细胞水肿明显减轻，炎细胞浸润减少，肌纤维排列紊乱减轻。提示CCM干预改善了心力衰竭动物心肌组织损伤。
5.自噬相关蛋白LC3免疫荧光染色
免疫荧光染色结果显示，假手术组动物心肌组织有基础量LC3免疫荧光阳性染色，呈现红荧光斑点；与假手术组相比较，心力衰竭组兔心肌组织LC3免疫荧光染色斑点密度增高，提示心力衰竭后动物心肌细胞自噬活动增强；与心力衰竭组相比较，CCM干预后动物心肌组织LC3免疫荧光染色减少，表现为阳性荧光斑点密度降低。提示CCM干预抑制了心力衰竭动物自噬活动的增强。
第二部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织自噬相关蛋白的影响
目的：采用兔慢性心力衰竭模型(升主动脉缩窄法)，观察CCM对心肌组织中自噬相关蛋白P62、Beclin1、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)表达的影响，进一步明确CCM对慢性心力衰竭兔心肌组织自噬活性的影响。
方法：动物及分组同第一部分，各组动物于升主动脉缩窄术或其sham手术后16周空气栓塞处死，于左室前壁取材，应用western-blotting蛋白印迹技术，比较各组动物心肌组织中自噬相关蛋白P62、Beclin1、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)的表达水平。
结果：
1.心力衰竭对Beclin1、P62、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达的影响
westernblot结果显示，假手术组动物心肌组织中Beclin1、P62、LC3B蛋白均有一定量的基础表达；与假手术组相比较，心力衰竭后(心力衰竭组)心肌组织中Beclin1蛋白表达明显上调，P62蛋白表达水平减低，LC3B蛋白表达明显增加，且LC3B(Ⅱ/Ⅰ)比值增加(P＜0.05)。
2.CCM刺激对Beclin1、P62、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达的影响
给予CCM干预后(CCM干预组)，与心力衰竭组相比较，心肌组织中Beclin1蛋白表达水平明显下降，P62蛋白表达水平明显升高，LC3B蛋白表达明显下降，且LC3B(Ⅱ/Ⅰ)比值下降(P＜0.05)。
上述结果提示，慢性心力衰竭导致心肌细胞自噬活动增强，CCM干预可有效抑制心力衰竭导致的心肌自噬活动增强。
第三部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织PI3K/AKT信号通路影响
目的：采用兔慢性心力衰竭模型(升主动脉缩窄法)，westernblot检测各组动物心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)、FOXO3、mTOR、TORC2、GSK-3β的蛋白表达情况，观察探讨CCM对心力衰竭兔心肌PI3K/AKT信号通路的影响，初步探讨CCM干预在心力衰竭动物自噬调控过程中的可能机制。
方法：动物及分组同第一部分，各组动物于升主动脉缩窄术或其sham手术后16周空气栓塞处死，于左室前壁取材，应用westernblot蛋白印迹技术，测定各组动物心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)、FOXO3、mTOR、TORC2、GSK-3β蛋白的表达情况。
结果：
1.CCM对心肌AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白表达影响
Westernblot结果显示假手术组心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白均有一定量的基础表达，与假手术组相比，心力衰竭组心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3蛋白的表达水平明显升高(P＜0.05)，PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白表达降低(P＜0.05)。给予动物CCM干预4周以后，与心力衰竭组相比，心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3蛋白表达水平明显降低，PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白表达增加(P＜0.05)。
2.CCM对心肌mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白表达影响
Westernblot结果显示假手术组的动物心肌组织中mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白均有一定量的基础表达。与假手术组相比，心力衰竭造成动物心肌组织中mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。给予心力衰竭动物CCM干预4周后，与心力衰竭组相比，心肌组织中mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)。
上述结果提示：CCM可改善慢性心力衰竭兔心肌舒缩功能，减轻心肌细胞自噬，这一作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。
结论：
1.升主动脉缩窄法可成功建立慢性心力衰竭兔动物模型。
2.心力衰竭时心肌细胞自噬活性升高，AKT、PI3K、mTOR，GSK-3β、FOXO3和TORC2蛋白表达异常。
3.CCM干预可减轻心肌细胞自噬，改善慢性心力衰竭兔心肌舒缩功能，这一作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。
研究发现，在心力衰竭的发病机制中，神经-体液调节机制的过度激活、炎症介质的释放、凋亡、自噬等因素与之关系密切。自噬(autophagy)是近年兴起的关于心力衰竭发生机制研究的热点，是指由自噬相关基因调控的，溶酶体介导的依赖性降解细胞内成分的机制，这些成分被回收用于能源供应或其他目的，通过自噬可以清除衰老受损的细胞器，以维持细胞的稳定。经典的自噬过程包括双层膜吞噬体结构的形成以吞噬细胞器或胞质成分，进一步通过溶酶体融合而降解。
自噬体的形成是自噬发生的重要环节，这一环节与自噬相关基因Atg(Autophagy associated gene, Atg)家族的功能关系密切。其中酵母Atg-6同系物Beclin-1是Atg表达蛋白的一种，当Beclin-1等Atg家族的蛋白表达增加时，可通过调节其他Atg蛋白在自噬前体中的定位，调控自噬体的形成，促进自噬活性增加。酵母自噬相关基因Atg-8的同源基因自噬微管相关轻链蛋白(Microtuble-associated protein 1 light chain 3, LC-3)是自噬过程中必须的泛素样通路关键蛋白，参与自噬体的形成，是自噬溶酶体形成过程中不可或缺的重要分子。在自噬形成过程中，胞浆中水溶性LC3Ⅰ与磷脂酞乙醇胺发生反应生成脂溶性LC3Ⅱ，分布于自噬体膜上，LC3Ⅱ的升高可作为自噬启动的标志，LC3Ⅱ蛋白的含量或LC3Ⅱ/LC3I的比例均与自噬体的数量呈正相关，可以在一定程度上反应细胞自噬的活性。自噬降解底物P62通过LC3识别序列与LC3作用并将泛素化蛋白转运至自噬体，把被降解物在自噬溶酶体中降解，P62则伴随着聚合物的清除而排除，当细胞的自噬活性升高时，P62蛋白表达下降，表现为与自噬程度呈负相关。
成人心脏心肌细胞再生率低，导致心肌细胞更新能力有限。因此，细胞内物质的更新循环在稳定心肌细胞功能和寿命方面至关重要。研究表明，自噬在心力衰竭的病理生理学中起重要作用。无论是在生理状态下还是在病理状态下，心肌的自噬过程对于防止大分子聚集和功能失调的细胞器的积累，维持细胞内环境的稳定都是至关重要的。生理状态下，自噬现象存在于人体的心肌中，自噬参与调控心肌细胞功能和寿命；在心肌肥厚、缺血缺氧等病理状态下，机体通过调控自噬过程来减少外界因素损害。自噬过程对心脏的作用是双重性的，一方面是保护性作用，即当心脏受到外界刺激时，适度自噬激活可稳定心肌细胞，保护心肌细胞免受死亡。另一方面是损害性作用，过度激活的自噬会导致细胞器破坏，从而促进心肌细胞死亡。
自噬过程受到多种信号转导通路的调控，如PI3K/AKT、AMPK、Beclin1、ROS等。PI3K/AKT信号转导通路是自噬过程中经典的信号转导通路，该通道主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB, Akt)组成。PI3K和Akt的激活可通过调控一系列下游蛋白，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、糖原合酶激酶(GSK)-3β、叉头转录因子(FOXOs)和某些Bcl-2家族成员来维持或改善细胞存活和心功能。研究发现，调控PI3K/AKT信号通道可以有效调控心肌细胞自噬活性，影响心肌重构，这在心力衰竭的发生发展过程中发挥着积极的意义。因此，寻找临床可行的干预手段，对心肌细胞自噬进行适度的调控，调节心脏重构，改善心功能，是临床心力衰竭治疗中要关注和研究的热点之一。
心脏收缩力调节(cardiac contractility modulation，CCM)是在心肌细胞绝对不应期内给予高强度电刺激，这种刺激并不引起心肌细胞除极，但能够提高心肌的收缩力，从而改善心脏功能，在慢性心力衰竭治疗中发挥重要作用。既往基础研究表明，CCM治疗可以改善心肌组织胚胎型基因的异常表达，使肌浆网钙循环基因和牵张反应基因表达正常化，可以调节钙离子转运相关蛋白(如肌浆网钙ATP酶、受磷蛋白等)表达及功能，从而发挥增强心肌收缩力作用。临床研究显示，CCM后可以改善患者心力衰竭临床症状，提高运动耐量和生活质量，降低心力衰竭的住院率。
本研究中采用慢性心力衰竭动物模型(升主动脉缩窄法)，观察CCM对慢性心力衰竭兔心肌细胞自噬的影响，并进一步观察CCM后心肌组织中AKT、PI3K、FOXO3、mTOR、TORC2、GSK3β蛋白表达水平的改变，初步探讨CCM在自噬调控中的可能机制，以期为临床应用CCM进行心力衰竭治疗的研究提供理论依据。
第一部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织自噬的影响
目的：建立兔慢性心力衰竭模型，通过超声心动图和血BNP水平反应兔心衰程度，HE染色观察心肌组织形态，免疫荧光染色观察自噬相关蛋白LC3的表达情况，初步探讨心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心功能和自噬的影响。
方法：30只健康新西兰大白兔随机分为3组：假手术组(Sham group)、心力衰竭组(HF group)、CCM干预组(CCM group)各10只。假手术组开胸后，随即关闭胸腔，不进行升主动脉缩窄操作；心力衰竭组开胸，在距离升主动脉根部以远1cm处环扎升主动脉至原周长60%；CCM组主动脉缩窄手术同心力衰竭组，环扎后在左心室前壁缝入小儿临时起搏电极。术后12周后检测心功能，达到心力衰竭标准的动物进行后续实验。各组动物继续分笼饲养4周，CCM干预组自第12周起开始连续进行电刺激4周。
各组动物分别于术前，术后12周和术后16周测定超声心动图，观察左室射血分数、左室短轴缩短率、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径指标，了解心脏收缩功能及左室腔大小变化。取静脉血检测血中B型脑钠肽水平，对比各组兔心脏功能及心力衰竭指标的变化；各组兔术后16周空气栓塞处死，于左室前壁取材，HE染色观察心肌组织结构改变，免疫荧光染色观察自噬相关蛋白LC3的表达，初步探讨CCM对慢性心力衰竭兔心脏功能和自噬的影响。
结果：
1.动物模型建立情况
术后12周时心力衰竭组和CCM干预组实验动物心脏超声检查结果均满足EF＜40%的诊断标准，同时表现出进食、饮水减少，体重增长缓慢，反应迟钝，呼吸急促等心衰临床表现，提示心力衰竭模型建立成功。除术中死亡外，术后16周各组实验动物均有9只存活。
2.心脏超声检查结果
术前三组实验动物心脏超声各指标无明显差别(P＞0.05)，左室射血分数为67.32±3.62%，左室短轴缩短率为34.39±3.04%，左室收缩末期内径为9.07±0.57mm，左室舒张末期内径为11.31±0.26mm。与假手术组相比较，升主动脉缩窄术后12周时心力衰竭组和CCM干预组动物左室射血分数(38.22±1.99%)、左室短轴缩短率(19.58±1.82%)均下降(P＜0.05)，而左室收缩末期内径(12.13±0.52mm)和舒张末期内径(14.70±0.77mm)升高(P＜0.05)，达到实验动物心力衰竭诊断标准，动物模型成功建立经过CCM干预4周后动物左室射血分数(45.22±1.86%)、左室短轴缩短率(22.72±1.15%)比心力衰竭组明显升高(P＜0.05)，而左室收缩末期内径(10.01±0.28mm)和舒张末期内径(12.94±0.48mm)较心力衰竭组明显降低(P＜0.05)。提示CCM干预改善了心力衰竭兔的心脏功能。
3.静脉血中B型脑钠肽水平
假手术组静脉血中B型脑钠肽基础水平为29.79±2.81ng/ml，三个实验组相比较无显著差异(P＞0.05)。升主动脉缩窄或其sham手术后12周，心力衰竭组和CCM干预组实验动物静脉血中B型脑钠肽水平与假手术组相比均明显升高，分别为61.12±5.78ng/ml和63.78?4.96ng/ml(P＜0.05)，提示动物出现了明显的心力衰竭，模型成功建立。CCM干预组中，经过CCM干预4周后，动物静脉血中B型脑钠肽水平较心力衰竭组明显下降，为49.52±2.95ng/ml(P＜0.05)，提示CCM持续干预有效减轻了兔升主动脉缩窄导致的心力衰竭。
4.组织病理学检查(HE染色)
假手术组实验动物心肌组织细胞排列有序，胞核均一、核仁饱满，心肌细胞形态大小正常。心力衰竭组中，升主动脉缩窄术造成了动物心肌细胞的广泛损害，表现为细胞肥大水肿，心肌纤维排列紊乱、断裂，部分心肌纤维缺失，大量炎细胞浸润。与心力衰竭组相比较，CCM干预4周后心肌组织的病理学损伤得到明显改善，细胞水肿明显减轻，炎细胞浸润减少，肌纤维排列紊乱减轻。提示CCM干预改善了心力衰竭动物心肌组织损伤。
5.自噬相关蛋白LC3免疫荧光染色
免疫荧光染色结果显示，假手术组动物心肌组织有基础量LC3免疫荧光阳性染色，呈现红荧光斑点；与假手术组相比较，心力衰竭组兔心肌组织LC3免疫荧光染色斑点密度增高，提示心力衰竭后动物心肌细胞自噬活动增强；与心力衰竭组相比较，CCM干预后动物心肌组织LC3免疫荧光染色减少，表现为阳性荧光斑点密度降低。提示CCM干预抑制了心力衰竭动物自噬活动的增强。
第二部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织自噬相关蛋白的影响
目的：采用兔慢性心力衰竭模型(升主动脉缩窄法)，观察CCM对心肌组织中自噬相关蛋白P62、Beclin1、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)表达的影响，进一步明确CCM对慢性心力衰竭兔心肌组织自噬活性的影响。
方法：动物及分组同第一部分，各组动物于升主动脉缩窄术或其sham手术后16周空气栓塞处死，于左室前壁取材，应用western-blotting蛋白印迹技术，比较各组动物心肌组织中自噬相关蛋白P62、Beclin1、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)的表达水平。
结果：
1.心力衰竭对Beclin1、P62、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达的影响
westernblot结果显示，假手术组动物心肌组织中Beclin1、P62、LC3B蛋白均有一定量的基础表达；与假手术组相比较，心力衰竭后(心力衰竭组)心肌组织中Beclin1蛋白表达明显上调，P62蛋白表达水平减低，LC3B蛋白表达明显增加，且LC3B(Ⅱ/Ⅰ)比值增加(P＜0.05)。
2.CCM刺激对Beclin1、P62、LC3B(Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达的影响
给予CCM干预后(CCM干预组)，与心力衰竭组相比较，心肌组织中Beclin1蛋白表达水平明显下降，P62蛋白表达水平明显升高，LC3B蛋白表达明显下降，且LC3B(Ⅱ/Ⅰ)比值下降(P＜0.05)。
上述结果提示，慢性心力衰竭导致心肌细胞自噬活动增强，CCM干预可有效抑制心力衰竭导致的心肌自噬活动增强。
第三部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织PI3K/AKT信号通路影响
目的：采用兔慢性心力衰竭模型(升主动脉缩窄法)，westernblot检测各组动物心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)、FOXO3、mTOR、TORC2、GSK-3β的蛋白表达情况，观察探讨CCM对心力衰竭兔心肌PI3K/AKT信号通路的影响，初步探讨CCM干预在心力衰竭动物自噬调控过程中的可能机制。
方法：动物及分组同第一部分，各组动物于升主动脉缩窄术或其sham手术后16周空气栓塞处死，于左室前壁取材，应用westernblot蛋白印迹技术，测定各组动物心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)、FOXO3、mTOR、TORC2、GSK-3β蛋白的表达情况。
结果：
1.CCM对心肌AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白表达影响
Westernblot结果显示假手术组心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3、PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白均有一定量的基础表达，与假手术组相比，心力衰竭组心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3蛋白的表达水平明显升高(P＜0.05)，PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白表达降低(P＜0.05)。给予动物CCM干预4周以后，与心力衰竭组相比，心肌组织中AKT1、AKT2、AKT3蛋白表达水平明显降低，PI3K(α110)、PI3K(α85)蛋白表达增加(P＜0.05)。
2.CCM对心肌mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白表达影响
Westernblot结果显示假手术组的动物心肌组织中mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白均有一定量的基础表达。与假手术组相比，心力衰竭造成动物心肌组织中mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。给予心力衰竭动物CCM干预4周后，与心力衰竭组相比，心肌组织中mTOR、TORC2、FOXO3、GSK-3β蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)。
上述结果提示：CCM可改善慢性心力衰竭兔心肌舒缩功能，减轻心肌细胞自噬，这一作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。
结论：
1.升主动脉缩窄法可成功建立慢性心力衰竭兔动物模型。
2.心力衰竭时心肌细胞自噬活性升高，AKT、PI3K、mTOR，GSK-3β、FOXO3和TORC2蛋白表达异常。
3.CCM干预可减轻心肌细胞自噬，改善慢性心力衰竭兔心肌舒缩功能，这一作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。