论文部分内容阅读
黑色素瘤是目前皮肤癌中发病率最高的恶性肿瘤之一，具备高侵袭性及强增殖能力，易发生淋巴及血行转移且预后差，发病率逐年上升。常规治疗主要包括：放射治疗、化学治疗、手术切除等综合治疗手段，但总体治疗效果仍不能尽如人意，生存期的延长不明显，成为当今人类健康的巨大威胁。因而，为实现对黑色素瘤患者早期诊断，赢得黄金治疗时间的目的，本研究拟建立一种双模态成像指导下用于黑色素瘤的协同治疗靶向纳米递药系统cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs，以期解决上述缺陷。即以cRGDyk肽为靶头，热敏脂质体(TSLs)为载体，包载化疗药物2-甲氧基雌二醇(2-ME)和光热治疗剂吲哚菁绿(ICG)，利用吲哚菁绿(ICG)的光热转换效果以实现药物的定位控释，产生局部热疗效应，同时增加药物在肿瘤部位的蓄积与摄取，降低其对正常组织的毒副作用；联合化疗与热疗提高抗肿瘤效果；通过NIR荧光成像与光声成像结合，以期实现双模态成像指导下靶向纳米递药系统用于黑色素瘤诊疗一体化。本课题研究内容主要分为以下四部分：
第一部分：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的制备与表征
采用薄膜分散法成功制备表面修饰cRGDyk肽且包载2-甲氧基雌二醇(2-ME)和吲哚菁绿(ICG)的热敏感型脂质纳米递药系统(cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs)。通过马尔文激光纳米粒度分析仪，透射电子显微镜，紫外可见分光光度仪等证明该递药体系成功制备；紫外光谱显示cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs具有(2-ME)288nm与(ICG)780nm左右2个特征吸收峰，表明该递药系统成功共载化疗药物2-甲氧基雌二醇(2-ME)和光热治疗剂吲哚菁绿(ICG)。激光粒度仪显示cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs平均粒径为128.4±0.6nm、电位为-20.8±1.2mV，TEM结果表明该纳米粒形态圆整，大小均一。2-ME和ICG的包封率、载药量分别为85.43±0.83%，90.84±0.32%；4.05±0.12%，2.09±0.16%。体外升温实验表明cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂在808nm激光辐射作用3min下快速提升温度至42℃以上，光热转换效率高。同时体外释药结果表明：在42℃孵育环境与37℃孵育环境下相比，药物的释药速度明显加快且药物累积释放量有显著性差异，提高了肿瘤部位的有效血药浓度。
第二部分：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体外抗肿瘤活性研究
以鼠源黑色素瘤细胞B16-F10为模型细胞，考察cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体外抗肿瘤活性。首先利用荧光显微镜及流式细胞仪分别从定性和定量两方面考察B16-F10对各实验组的摄取情况；随后使用MTT法考察各实验组对B16-F10细胞的增殖抑制作用；最后使用流式细胞仪分析各个实验组对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和细胞内活性氧水平的影响。摄取实验结果显示，制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在激光作用下对B16-F10摄取效果最为显著，这主要归因于cRGDyk肽的主动靶向作用促使脂质纳米载体进入肿瘤细胞，证明其优异的体外靶向性；MTT实验显示，相比于其他实验组，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组在激光条件下对肿瘤细胞具有最强的抑制作用；细胞凋亡和细胞周期实验结果进一步表明，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组在激光照射下能够高效诱导细胞凋亡，并通过将细胞阻滞于G2/M期来抑制肿瘤细胞增殖；此外，制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在近红外激光照射下显著增加了细胞内活性氧含量，进一步加剧肿瘤细胞损伤。
第三部分:：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的NIR荧光/光声双模式成像研究
选用Balb/c荷瘤小鼠为模型动物，利用小动物活体成像仪，记录cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在小鼠体内荧光成像效果，同时于活体成像荧光富集最大处进行离体器官成像，结果表明制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在24h能在肿瘤部位达到最大富集。同时利用上述动物模型，利用光声成像仪，观察cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs体内光声成像效果。结果表明：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在肿瘤部位呈现明显的时间依赖性，并在药物作用24h后光声信号在肿瘤部位达到最大富集，与荧光成像结果一致。
第四部分：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs药代动力学与体内抗肿瘤活性研究
以SD大鼠为模型动物，研究制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体内药代动力学特征。结果表明：相比于2-ME原料组，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组消除半衰期与平均滞留时间显著延长，血浆清除速率明显降低，2-ME生物利用度得到显著提高，表明制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs可以使药物在蓄积在靶部位并发挥更持久的抗肿瘤作用。
选择C57荷瘤小鼠为模型动物，静脉给药，并在激光作用下研究cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体内抗肿瘤活性。结果显示从瘤体积，瘤重等指标看来，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在激光作用下抑瘤作用明显。HE结果显示，激光条件下，制剂组增强了抑瘤作用，但对主要脏器没有明显的毒副作用。PCNA和TUNEL结果表明：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在激光作用下能够发挥高效抗肿瘤治疗效果，使治疗效果最佳。以上结果表明cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组的体内抗肿瘤活性良好，毒副作用小，能起到减毒增效的作用效果。
第一部分：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的制备与表征
采用薄膜分散法成功制备表面修饰cRGDyk肽且包载2-甲氧基雌二醇(2-ME)和吲哚菁绿(ICG)的热敏感型脂质纳米递药系统(cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs)。通过马尔文激光纳米粒度分析仪，透射电子显微镜，紫外可见分光光度仪等证明该递药体系成功制备；紫外光谱显示cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs具有(2-ME)288nm与(ICG)780nm左右2个特征吸收峰，表明该递药系统成功共载化疗药物2-甲氧基雌二醇(2-ME)和光热治疗剂吲哚菁绿(ICG)。激光粒度仪显示cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs平均粒径为128.4±0.6nm、电位为-20.8±1.2mV，TEM结果表明该纳米粒形态圆整，大小均一。2-ME和ICG的包封率、载药量分别为85.43±0.83%，90.84±0.32%；4.05±0.12%，2.09±0.16%。体外升温实验表明cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂在808nm激光辐射作用3min下快速提升温度至42℃以上，光热转换效率高。同时体外释药结果表明：在42℃孵育环境与37℃孵育环境下相比，药物的释药速度明显加快且药物累积释放量有显著性差异，提高了肿瘤部位的有效血药浓度。
第二部分：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体外抗肿瘤活性研究
以鼠源黑色素瘤细胞B16-F10为模型细胞，考察cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体外抗肿瘤活性。首先利用荧光显微镜及流式细胞仪分别从定性和定量两方面考察B16-F10对各实验组的摄取情况；随后使用MTT法考察各实验组对B16-F10细胞的增殖抑制作用；最后使用流式细胞仪分析各个实验组对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和细胞内活性氧水平的影响。摄取实验结果显示，制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在激光作用下对B16-F10摄取效果最为显著，这主要归因于cRGDyk肽的主动靶向作用促使脂质纳米载体进入肿瘤细胞，证明其优异的体外靶向性；MTT实验显示，相比于其他实验组，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组在激光条件下对肿瘤细胞具有最强的抑制作用；细胞凋亡和细胞周期实验结果进一步表明，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组在激光照射下能够高效诱导细胞凋亡，并通过将细胞阻滞于G2/M期来抑制肿瘤细胞增殖；此外，制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在近红外激光照射下显著增加了细胞内活性氧含量，进一步加剧肿瘤细胞损伤。
第三部分:：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的NIR荧光/光声双模式成像研究
选用Balb/c荷瘤小鼠为模型动物，利用小动物活体成像仪，记录cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在小鼠体内荧光成像效果，同时于活体成像荧光富集最大处进行离体器官成像，结果表明制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在24h能在肿瘤部位达到最大富集。同时利用上述动物模型，利用光声成像仪，观察cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs体内光声成像效果。结果表明：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在肿瘤部位呈现明显的时间依赖性，并在药物作用24h后光声信号在肿瘤部位达到最大富集，与荧光成像结果一致。
第四部分：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs药代动力学与体内抗肿瘤活性研究
以SD大鼠为模型动物，研究制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体内药代动力学特征。结果表明：相比于2-ME原料组，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组消除半衰期与平均滞留时间显著延长，血浆清除速率明显降低，2-ME生物利用度得到显著提高，表明制剂组cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs可以使药物在蓄积在靶部位并发挥更持久的抗肿瘤作用。
选择C57荷瘤小鼠为模型动物，静脉给药，并在激光作用下研究cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs的体内抗肿瘤活性。结果显示从瘤体积，瘤重等指标看来，cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在激光作用下抑瘤作用明显。HE结果显示，激光条件下，制剂组增强了抑瘤作用，但对主要脏器没有明显的毒副作用。PCNA和TUNEL结果表明：cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs在激光作用下能够发挥高效抗肿瘤治疗效果，使治疗效果最佳。以上结果表明cRGDyk-2-ME@ICG-TSLs制剂组的体内抗肿瘤活性良好，毒副作用小，能起到减毒增效的作用效果。