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角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是目前全球范围内主要的致盲眼病之一,也是角膜移植排斥反应发生的高危因素。对CNV发生机制及其防治措施的研究一直以来都是眼科学界的一个热点,迄今为止,CNV的发生机制尚未完全清楚。目前认为,CNV的发生与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)密切相关,它被认为能特异性地促进血管内皮分裂、增殖及迁移,是公认血管生成的中心调节者,也是目前所发现的最有力的促血管形成因子之一。Bevacizumab(Avastin) 是一种抗 VEGF人源化单克隆抗体,可以同所有已知VEGF异构体结合,通过抑制其生物学活性间接阻断 VEGF和其受体的结合而阻止血管渗漏和新生血管的形成。近几年,由于其对血管源性眼病,特别是对新生血管性 AMD(老年性黄斑变性)的良好疗效,成为目前世界眼科学界的关注焦点。为了观察其对角膜新生血管的治疗作用,我们以基础实验方法制造兔眼角膜CNV模型,Bevacizumab(Avastin)球结膜下注射干预治疗,观察CNV的生长和角膜组织及房水中VEGF的表达情况,为临床治疗角膜新生血管提供理论依据和新的思路。我们的研究分为两个部分。
第一部分、角膜新生血管模型的制作
目的:制作经济稳定重复性好的兔眼角膜新生血管模型。
方法:新西兰大白兔6只,选左眼为实验眼,随机分为2组,A组为角膜碱烧伤组,采用1mol/L 氢氧化钠(NaOH),8mm的滤纸片浸润,烧灼时间为1min;B组为角膜缝线组,用6/0丝线在角膜4个象限分别间断缝合,缝线深度约2/3角膜厚度,缝线穿过角膜基质层的长度约3.0mm。术后每日在手术显微镜下观察兔眼角膜混浊,角膜溃疡,CNV生长情况并于术后14d计算其面积。
结果:A组兔角膜NaOH烧伤后,1d角膜混浊明显,中央少量溃疡,角膜缘血管充血明显,2只兔于7d时角膜缘出现CNV芽,1只兔于10d出现,14d平均CNV面积14.92±7.46 mm2。B组兔角膜6/0丝线板层缝合后2d,3只兔均可见角膜缘血管环充血扩张,CNV芽呈细小毛刷状长入透明的角膜,整齐而密集;7d时均见CNV生长,14dCNV密集,管径粗大,色鲜红,平均CNV面积34.77±4.09 mm2。角膜未见混浊和溃疡。统计分析后B组CNV面积显著大于A组,差异有统计学意义(P<0.01)。B组变异系数(16.73%)小于A组(55.58%)。
结论:NaOH碱烧伤和角膜缝线法都能制作兔眼CNV模型,缝线法相对稳定重复性好。
第二部分、Bevacizumab(Avastin)抑制兔眼角膜新生血管的实验研究
目的:观察Bevacizumab(Avastin)球结膜下注射对角膜缝线诱导兔眼新生血管的治疗作用。
方法:新西兰大白兔48只,随机分为正常对照组(A组3只)、实验对照组(B组9只)和实验组(C组36只),C组又分为四组:1天小剂量治疗组(C1组9只)和1天大剂量治疗组(C2组9只),14天小剂量治疗组(C3组9只)和 14天大剂量治疗组(C4组9只)。建模方法为:手术显微镜下,兔左眼用6-0丝线在角膜4个象限分别间断缝合,缝线深度约2/3角膜厚度,缝线穿过角膜基质层的长度约3.0mm,制备角膜新生血管(Corneal Neovascularization,CNV)动物模型。A组为正常对照组,既不缝线也不治疗。动物模型制备后第1d,在C1和C2组兔眼球结膜下分别注射Bevacizumab(Avastin)0.1ml和0.2ml;第14d在B组兔眼球结膜下注射生理盐水0.2ml;在C3和C4组兔眼球结膜下分别注射Bevacizumab(Avastin)0.1ml和0.2ml。术后每日在手术显微镜下观察兔眼角膜CNV生长情况并计算其面积,且于建模后7,14,28d分别拍照记录,用免疫组化方法检测各组角膜组织中VEGF的表达情况,酶联免疫吸附测定法(ELISA) 检测房水内VEGF含量。
结果:将各组的 CNV生长情况及角膜组织炎症细胞浸润程度比较后发现:在7d,14d,28dC1和C2组均较B组明显减轻(P<0.01),28d时C3组CNV和炎症细胞浸润程度较B组明显减轻(P=0.006<0.01),C4组较B组明显减轻(P=0.002<0.01);28d时C1组较C3组明显减轻(P<0.01),C2组较C4组明显减轻(P<0.01)。角膜免疫组织化学染色后发现:角膜组织中VEGF主要定位于上皮细胞、基质纤维细胞、内皮细胞、浸润的炎症细胞及新生血管内皮细胞胞质中。B组角膜组织中VEGF表达的阳性率随时间推移逐渐增高,且表达强度与CNV面积的大小具有正相关(r=0.923,P<0.01)。角膜VEGF的表达在缝线后7d,14d,28d时C1和C2组均低于B组(P<0.05),28d时 C3和 C4组也均低于B组(P=0.034<0.05);28d时角膜VEGF的表达 C1组低于C3组(P=0.025<0.05),C2组低于C4组(P=0.034<0.05)。兔眼房水ELISA分析后发现:B组房水中 VEGF的含量随着时间的推移逐渐增长,在缝线后7d,14d,28d均高于正常对照组(A组),并且房水中VEGF的浓度与角膜组织中VEGF表达和CNV面积呈正相关。房水VEGF浓度在C1,C2组用药后7d,14d,28d均低于B组(P<0.01),28d时C3,C4组均低于B组(P<0.01)。28d房水VEGF的浓度C1组低于C3组(P=0.009<0.01),C2组低于C4组(P=0.006<0.01)。C1和C2组之间以及C3和C4组之间在CNV面积,角膜和房水中VEGF的表达均无显著差异。
结论:球结膜下注射Bevacizumab(Avastin)可抑制CNV生长,且早期用药比晚期用药疗效更加显著。 Bevacizumab(Avastin)可以下调角膜组织VEGF的表达及房水中的VEGF含量,角膜及房水中的VEGF 可能在 CNV形成过程中发挥着重要的调控作用。