研究背景 TNF-α是一种生物学活性十分广泛的细胞因子，它主要由巨噬细胞和活化的T细胞产生。它通过与细胞膜表面的受体结合而发挥效应。人TNF-α的受体有两种，相对分子重量55-60KD的TNFRp55和75-80KD的TNFRp75。TNF只有与细胞表面的受体结合才能发挥效应。已知这两种受体介导不同的生物学效应。其中TNFRp55可以诱导细胞凋亡，同时活化MnSOD和NF-KB；TNFRp75仅诱导原始胸腺细胞和T细胞的增殖，并具有微弱的拮抗TNF的细胞毒性的作用。由于TNF可以引起肿瘤的出血坏死这一特性，自八十年代起，人们就开始研制rhTNF作为临床的抗肿瘤药物，目前由我校生物技术中心研制的nrhTNF已经进入三期临床试验。然而大量的临床报道表明，尽管nrhTNF具有强大的抗癌作用，但是其疗效并不稳定，且可以引发严重的毒副作用，制 第四草医大学硕士毕位论文 约了它的临床应用。为了提高疗效降低毒副作用，人们进行了各方面的研究， 其中对NFth途径激活的研究一直是热点。由于核转录因子NF－h可以被TNF 激活，通过激活 11LAFI，TI；LAI72，。－IAP和 IAPZ等，这些基因产物抑制 TN－－－a 诱导的细胞凋亡；同时NFth能直接阻断caspaseE，从而抑制一系列caspase 级联反应。 目的 探讨 TNFRp55和 yFRp75在各种肿瘤细胞中的表达，以及hFRpp55一 的表达与TNF对肿瘤细胞生长的抑制作用的关系，并进一步探讨nxhTNF对 肿瘤细胞中NFKB活化的影响。 方法 山 120例肿瘤组织标本经石蜡包埋后制成切片；同时，10株体外培养 的肿瘤细胞（人肺癌细胞 A549 和 PLA801、人肝癌细胞 SMMC7721 和 BEL－7402、人宫颈癌细胞Hela、人卵巢癌细胞8910、人结肠癌细胞SW480。 人胃癌细胞SGC7901、人食管癌细胞Ecal09和人膀恍癌细胞GRCl）和 1株 对照用细胞（小鼠成纤维细胞L929）均制成细胞爬片，采用免疫组化的方法 对细胞上 hFRp55和 TNFRp75的表达及分布进行分析。C）10株肿瘤细胞j 和 L929细胞均接种于 96 IL板上，将 nrh州F以 IXIO’IU加l为起始浓度，逐 级4倍稀释，最后获得8个稀释浓度。将稀释好的样品依次加入96孔板，经 1 培养过夜后，镜检在半数死亡孔达到D或者E时终止反应，再经结晶紫染色 和脱色，酶标仪570urn测得OD值。最后根据公式抑制率（％）一门－实验组 OD值／对照组 OD值）X 100％计算每株细胞的抑制率。m根据细胞毒性实验 结果，将肿瘤细胞分为hF敏感型和TNF不敏感型两组，经nrhTNF刺激后 通过免疫组化染色观察细胞中NF－h的核移位情况；同时提取核蛋白，通过 western blot观察细胞中 NFth的核移位情况。 结果（1）病理切片中 TNFRp55和TNFRp乃的免疫染色阳性物质呈棕黄色颗7粒状位于细胞质和细胞膜上，多为弥散性分布，部分呈局灶性，少数散在分布。 我们检测的120例肿瘤组织中TN FRp55阳性表达99例，h FRp75阳性表达 101 例，阳性表达率分别为82．5％和84卫％，两受体的表达无显著性差异 2 可四军医大毕硕士坎位论文 （尸＞0＊引。IO株肿瘤细胞系中h F即55和TNF印乃 的表达分别为99＊％和 98．8％，主要定位于细胞膜上，不同细胞间和同一细胞的两种受体间的表达均 无显著性差异中＞0刀5人 o）肿瘤细胞在含有不同浓度讪TN F的培养液中培 养18h后，观察细胞形态变化。随着。h TNTNF的浓度的增加，S WW480SGC79m。。8910、SMMC7721和 BEL7402细胞存活率明显下降。而 A549、PLA801、Hela、 Ecal 09和 GRCl细胞在同样的条件下培养，rrhTNF不影响其细胞生长。（3）根 据以上结果，将肿瘤细胞分为 TNF敏感型和 T’NF不敏感型两组，每组随机选 取 3株细胞，分别为 A549、GRC－1和 Hela（TNF不敏感型）和 SMMC7721。 SW480和 BEL7402（TNF敏感型）。免疫组化染色法结果显示，在未受 nrhT’NF 刺激的肿瘤细胞中NFth均表达于细胞浆中；经nrhThF刺激后，它向核内移 位，而且随着与nrh’INF作用时间的延长，NFth向核内聚集的量逐渐增加。 其中，在hF不敏感型细胞中NF－oh的核移位现象较T’NF敏感型细胞明显。 westem blot结果显示，未受nrhTNF刺激的肿瘤细胞的核蛋白提取液中，所 有细胞均没有NF－h的表达；经nrhThF刺激后，出现NFth的表达，且随／mh hhF作用时间的推移，核蛋白提取液中N卜。B的表达量逐渐增加，且TN F 不敏感型细胞增加的程度较TNF敏感型明显。