甘肃鼢鼠(Myospalax cansus)隶属啮齿目(Rodentia)、鼹形鼠科(Spalacidae)、鼢鼠亚科(Myospalacinae)、鼢鼠属(Myospalax),主要分布于黄土高原,终生营严格地下洞道生活,是一种典型的地下鼠。由于甘肃鼢鼠世代生活于低氧、高二氧化碳的洞道环境,为适应这种特殊环境,形成了一系列适应地下低氧、高二氧化碳的生理生化机制,成为研究低氧适应机制的理想模式动物。甲硫氨酸硫氧化物还原酶(MsrA)是一种较小的胞质内酶,在生物体内普遍存在。MsrA是体内抗氧化系统中的重要组成部分,其主要功能是修复蛋白质和清除活性氧,使机体功能蛋白免受活性氧的氧化损伤,从而维持正常的生物活性。对不同物种的研究均说明,MsrA具有加强细胞或生物抗氧化应激的作用,不同物种间MsrA基因具有高度同源性,不同种属的MsrA氨基酸序列保守。MsrA存在于哺乳动物所有组织,但在不同的组织中表达量不同。本研究以甘肃鼢鼠为研究对象,旨在初步探讨抗氧化系统在动物低氧适应中的作用。运用荧光实时定量PCR技术对甘肃鼢鼠和SD大鼠在不同低氧条件下脑和肝组织中MsrA mRNA表达量进行比较：通过RT-PCR技术克隆甘肃鼢鼠MsrA基因cDNA序列,预测氨基酸序列；运用生物信息学对甘肃鼢鼠MsrA蛋白序列进行分析。研究结果如下：1.运用荧光实时定量PCR比较甘肃鼢鼠和SD大鼠在不同低氧条件下,脑和肝组织中MsrA mRNA的表达。结果表明,甘肃鼢鼠和SD大鼠肝中急性低氧组相对常氧对照组表达极显著增加,慢性低氧组相对常氧组无显著差异,与急性低氧组相比,表达极显著下降,说明急性低氧刺激肝组织MsrA mRNA表达。SD大鼠与甘肃鼢鼠相比,急性低氧相对常氧组表达量增加更显著,说明SD大鼠对急性低氧刺激反应更强烈,可能是因为甘肃鼢鼠长期适应地下低氧环境,肝脏对外界氧压降低的刺激相比SD大鼠不敏感,具有良好的低氧耐受力。在脑组织中,甘肃鼢鼠急性低氧组MsrA mRNA表达相对常氧组无显著差异,慢性低氧组相对常氧组和急性低氧组均极显著增加。说明急性低氧处理不能刺激其脑组织MsrA mRNA表达,机体可能通过其它的生理反应适应严重缺氧环境,脑组织MsrA mRNA表达上调是甘肃鼢鼠适应慢性低氧环境的表现,推测这是甘肃鼢鼠抗衰老、保持长寿特征的机制之一。SD大鼠脑组织中MsrA mRNA表达在三组处理组间均无显著差异。推测SD大鼠脑细胞抗氧化能力有限,急性缺氧已对其机体造成严重损伤,机体不能有效地修复这些损伤。另外,两种动物在各种处理条件下,脑组织表达量均极显著高于肝组织,表现出明显的组织特异性,说明MsrA在脑组织中有特殊的生理功能。2.甘肃鼢鼠MsrA基因cDNA的CDS区序列全长699bp,包含一个开放阅读框,编码232个氨基酸。利用NCBI中BLAST对其序列同源性进行检测,发现所测序列与伽利尔盲鼹鼠(Spalax galili)同源性最高,91%,与序列处理在线工具包(SMS) ORF查找器查找结果一致。可初步判定,该序列为甘肃鼢鼠MsrA基因全长cDNA序列,能编码完整MsrA蛋白质序列,可进行后续实验及数据分析。3.生物信息学分析MsrA蛋白序列。采用ProtParam对MsrA蛋白质理化性质进行分析,MsrA蛋白分子式C1145H1764 N328O326S10,分子质量约25.7kDa,理论等电点pI=9.33,共包括3573个原子,根据Guruprasad方法分析,MsrA蛋白为稳定蛋白；利用软件signalP-3.0server对MsrA蛋白质进行信号肽分析,显示MsrA蛋白无信号肽,为非分泌蛋白质；TMpred对甘肃鼢鼠MsrA跨膜区分析表明,甘肃鼢鼠MsrA蛋白无跨膜区；TargetP 1.1对蛋白亚细胞定位进行预测,显示该蛋白分泌途径为M型,定位线粒体；通过ProtScale,并采用Hphob./Kyte & Doolittle方法计算疏水性,发现整个蛋白质中疏水性最大值是1.900,最小值是-2.500；COILS Server预测该蛋白卷曲螺旋,发现甘肃鼢鼠MsrA蛋白含一个典型卷曲螺旋结构；CDD分析甘肃鼢鼠MsrA序列保守结构域,显示甘肃鼢鼠MsrA具有磷酸核酮糖激酶(PRK)保守结构域,属于甲硫氨酸硫氧化物还原酶(Peptide Methionine Sulfoxide Reductase, PMSR)超家族。PredictProtein分析MsrA蛋白功能基序,发现该蛋白序列有多个功能位点,包括2个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、7个N端糖基化位点；二级结构主要以a-螺旋和不规则卷曲为主,MsrA蛋白是mixed型；利用SwissModel全自动模式(Automated Mode)进行三级结构预测,显示甘肃鼢鼠MsrA蛋白最匹配模板是1fvaB,最佳比对区域位于序列第28-227位氨基酸残基,序列一致性83.58%,e值2.07e-94。利用ClustalX将甘肃鼢鼠MsrA基因序列与裸鼢鼠(Heterocephalus glaber)、人(Homo sapiens)、鼠兔(Ochotona princeps)、亚马逊松鼠猴(Saimiri boliviensis)、突尼斯非洲跳鼠(Jaculus jaculus)、伽利尔盲鼹鼠(spalax galili)、小鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)和草原田鼠(Microtus ochrogaster)相应序列进行对比,发现甘肃鼢鼠MsrA基因与伽利尔盲鼹鼠同源性最高,91%,与突尼斯非洲跳鼠和草原田鼠同源性86%,与人、亚马逊松鼠猴和小鼠85%,与裸鼢鼠、鼠兔及褐家鼠同源性84%,说明各物种间MsrA基因进化较保守,序列较相似。甘肃鼢鼠MsrA氨基酸序列与伽利尔盲鼹鼠同源性最高,92%,与鼠兔、突尼斯非洲跳鼠、亚马逊松鼠猴、草原田鼠、人、裸鼢鼠、褐家鼠及小鼠同源性分别是88%、85%、83%、83%、81%、81%、81%及80%。MsrA进化树表明,甘肃鼢鼠MsrA与伽利尔盲鼹鼠MsrA遗传距离最小,进化关系最近,与其他物种遗传距离相对较远,与褐家鼠遗传距离最远。运用DIVERG 3.0软件计算地下鼠与地面鼠MsrA功能分化系数,0=0.8144,说明地下鼠与地面鼠MsrA存在明显功能分化。理论上预测关键位点,共有48个可能功能分化决定位点,其中QK>0.9的位点共有48位,QK>0.95位点有4位。采用PAML软件,对甘肃鼢鼠MsrA基因编码序列进行选择压力分析,预测出3个正选择位点：第15位半胱氨酸、第16位精氨酸、第163位天冬氨酸。甘肃鼢鼠MsrA基因在漫长进化过程中,发生了功能分化和正选择适应,这是其对地下低氧高二氧化碳共同生态位的趋同进化,推测是适应地下洞道低氧环境的分子机制之一。