为改进黑曲霉对外源蛋白的分泌表达，本论文在黑曲霉GICC2773中已分别构建的二肽蛋白酶基因dppⅣ、dppⅤ，及甘露糖转移酶基因mnn9这三个单基因缺失突变株的基础上，利用amdS双向选择标记，通过同源重组的方法构建这三个基因的多缺失突变株，以研究这些基因缺失叠加对外源蛋白表达分泌的影响，为构建更理想的外源蛋白高效表达分泌的黑曲霉宿主基因工程菌奠定基础。本论文还构建黑曲霉htmA基因的缺失突变体，为进一步研究黑曲霉内质网中的htmA基因对外源蛋白的作用奠定了基础。以上研究取得的结果如下： 1．黑曲霉 dppⅣ，dppⅤ双基因缺失菌株的构建及功能分析：以插入潮霉素抗性基因(hph)而产生的dppV单基因缺失突变株A．niger ΔdppV#26为受体，将含有dppⅣ基因上游同源臂1226bp，下游同源臂1099 bp及其间插入amdS表达单元的线性片段进行原生质体—PEG转化。通过AMDS选择平板得到68个 amdS+转化子。PCR检测了其中的12个转化子，最终确定ΔdppⅤΔdppⅣ#2-3为dppⅣ，dppⅤ双基因缺失菌株。dppⅣ和dppⅤ基因的双缺失使外源蛋白漆酶分泌的比活性提高了34.6％，表明：dppⅣ和dppⅤ缺失的组合对外源蛋白的分泌表达具有很好的叠加效应，可进一步提高外源蛋白的分泌能力。 2．黑曲霉双向选择标记amdS自发突变株的筛选及amdS—检测：以A．nigerΔdppⅤΔdppⅣ#2-3为受体株，利用只有amdS—能够在以尿素为唯一氮源的氟代乙酰氨培养基上更好的生长特性，筛选出A．nigerΔdppⅤΔdppⅣ#2-3的amdS基因自发突变株。在74个侯选的amdS—突变菌株中得到2株amdS—突变菌株。以其中一株FΔdppⅤΔdppⅣ#4.55为受体株，用以amdS作选择标记的mnn9基因缺失质粒进行转化。通过AMDS选择平板得到248个amdS+转化子。PCR检测了其中的50个转化子，得到一株ΔdppⅤ，ΔdppⅣ、Δmnn9三基因缺失菌株：ΔdppⅤΔdppⅣΔmnn9#31-7。结果表明：在黑曲霉中利用amdS作为双向选择标记为构建多基因缺失菌株提供了方便。 3．黑曲霉dppⅣ，ppⅤ、mnn9三基因缺失株的构建及功能分析：以FΔdppⅤΔdppⅣ#4.55为受体株，将以amdS为选择标记含有mnn9基因上游同源臂1828bp，3下游端同源臂1240bp的线性片段进行原生质体—PEG转化。通过AMDS选择平板得到248个amdS+转化子。PCR检测了其中的43个转化子，发现转化子ΔdppⅤΔdppⅣΔmnn9#31-7为dppⅤ，dppⅣ、mnn9三基因缺失突变株。但发酵实验结果表明ΔdppⅣΔdppⅤΔmnn9三基因缺失株的外源蛋白漆酶的分泌能力与ΔdppⅣΔdppⅤ双基因缺失株的外源蛋白漆酶的分泌能力比较并没有明显的提高。 4．黑曲霉htmA基因缺失株的构建及功能分析：以Aspergillus niger GICC2773基因组DNA为模板，用PCR方法扩增htmA基因。将扩增片段克隆到pUCm—T载体上，通过在基因Stu Ⅰ/SnabⅠ位点插入A．nidulans的amdS表达单元构建缺失质粒pUCΔhtmA—amd。将NruⅠ酶切pucΔhtmA—amd得到的带有amdS插入的htmA基因线性片段转化A．niger GICC2773菌株，通过AMDS选择平板得到107个andS+转化子。PCR检测了其中的33个转化子，发现转化子#33-10为htmA基因缺失株。外源漆酶分泌活性动态分析表明黑曲霉htmA基因的破坏延缓了外源漆酶的降解。