小麦种子内源性物质及基因组DNA甲基化对小麦面筋品质的影响研究

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影响小麦面筋品质的因素有很多,内在因素主要受种子储藏蛋白的类型和含量,及其它内源性物质的影响,如内源性面筋形成交联酶和氨基酸合成酶。HMW-GSs和LMW-GSs主要通过二硫键和酪氨酸键形成面筋空间结构。交联酶通过影响二硫键,酪氨酸键及其它键的数目和类型影响面筋交联和特点,从而影响小麦面筋品质。半胱氨酸是面筋交联共价键二硫键的主要来源,其主要合成酶乙酰丝氨酸转移酶(SAT)和半胱氨酸合成酶(OAS-TL)对面筋品质起着不可忽视的作用。外在因素主要是环境气候条件,如小麦灌浆期的温度高低,氮肥的施用量等均可以影响面筋的形成。已有研究结果表明沉降值高低与面筋品质成极显著正相关。本文主要从种子内源性物质变化对小麦面筋品质的影响以及种子内源性物质基因表达调控的方式进行研究。其研究结果如下:  1.对122份国内外小麦材料进行Glu-A3基因等位变异鉴定,根据基因等位变异与SDS沉降值之间的关系,筛选出了一个优质高分子谷蛋白GluA3d亚基。方差分析显示含有Glu-A3等位基因的材料SDS沉降值均值之间差异显著,Glu-A3位点基因的等位变异能解释SDS沉降值变异的9.09%,7个等位基因中含等位基因gluA3a,gluA3g和gluA3d的材料其平均沉降值都较高,而含gluA3b,gluA3f,和gluA3e的材料其平均沉降值都较低。不同HMW亚基背景下的分析结果也符合这个规律。等位基因gluA3e在地方材料中出现的频率很低,gluA3e所属材料的SDS沉降值均值显著低于所有材料沉降值均值;国外引进材料中出现频率最低的等位基因gluA3d,其所属材料SDS沉降值均值显著高于所有材料的SDS沉降值均值。这些特异材料有待进一步研究,可以作为面筋品质改良的亲本,等位基因可作为品质选育的指标。  2.探索出了小麦种子POD测定的最佳方法。小麦种子中的过氧化物酶的活性可以通过分光光度计采用愈创木酚来进行测定。本研究比较了不同提取条件(3个不同缓冲液,3种不同的提取方法,4种不同的提取时间,6个不同的提取温度,4种不同的提取离心速率)对酶活测定的影响。结果表明,醋酸盐比用磷酸钾和磷酸钠作为缓冲液,测定值更高。而以KH2PO4提取的酶液,其酶活值在18个小时内变化最小,最稳定。在提取方法上,先研磨再加提取液震荡浸泡测定,比加提取液研磨测定其测定酶活值重复性更高。不同的材料其最适的提取温度和提取时间是不相同的,所以只要能保证酶活尽量没有损失即可。另外,离心速率的不同对POD的测得值并没有显著影响,但不可过低,否则得不到澄清的上液。所以小麦种子POD测定应先研磨再加提取液测定,提取液使用KH2PO4,提取温度4℃,提取时间30min,提取离心速率为10000×g最好。  3.小麦籽粒过氧化物酶(POD)与小麦(Triticum aestivum L.)面筋品质密切相关。本研究选用120份小麦材料(系),用分光光度计法测定了2年度(2012,2013)POD活性,并进行了聚类分析(最长距离法(Euclidean distance))和阳离子活性电泳检测。结果表明,2年测定的供试小麦材料(系)间的POD活性均达到极显著差异,年份间POD活性相关极显著(r=0.5143)。2个年度的材料(系)间差异顺序基本一致,POD活性主要受遗传控制。120份材料POD活性聚类分析为6类,每类酶活平均值和每类SDS沉降值大于4mL的材料(系)数占每类中总材料数比例之间呈现显著相关性(r=0.939),验证了POD活性影响面筋品质。  4.初步研究证明谷胱甘肽还原酶(GR)对面筋品质起负向作用。本研究对普通小麦种子中的细胞质GR进行克隆并测序,得到了同源性达到96.7%的两个细胞质GR:TaGR2-1和TaGR2-2。TaGR2-1(TaGR2-2)这两个序列拥有一个相同的开放阅读框(1,490bp),没有叶绿体转运信号序列,其编码蛋白由496个氨基酸残基组成,分子量为53031.8Da(52900.5Da),等电点为5.93(5.93)。通过同源性分析显示TaGR2-1位于染色体6AL,而TaGR2-2位于染色体6DL。TaGR2在小麦种子中开花后5天开始表达。其表达量和酶活在氮胁迫下都有增加,但是变化模式在灌浆初期并不一致。同时氮胁迫下,品质参数降低。说明GR可能和GSH一样对小麦面筋品质具有负向影响。  5.分析结果显示二硫键异构酶(TaPDI1)的变异系数大于高分子麦谷蛋白亚基Dx2+Dy12的变异系数,说明这个内源性酶基因可能比劣质高分子亚基对小麦面筋品质的影响更大。检测各种小麦种子内源性酶基因在氮胁迫下的基因转录表达变化,这些基因包括储藏蛋白HMW-GS和LMW-GS基因,蛋白质合成相关酶基因半胱氨酸合成酶(OAS),丝氨酸乙酰转移酶(SAT),谷胱甘肽还原酶(GR);交联酶基因包括二硫键异构酶(PDI),过氧化物酶(POD),硫氧还蛋白类(Trxh)基因。结果表明,所有的麦谷蛋白基因的表达高峰期在灌浆中期,另外HMW-GS在氮胁迫下,其基因表达都有下降,而LMW-GS基因则有些上调,有些下降。内源性酶基因除了POD之外,其表达高峰期在灌浆期前期和后期,除了GR之外,氮水平的提高都可以促进这些酶基因的表达。另外,分析结果显示氮胁迫导致基因转录表达量变化排在前7位都是麦谷蛋白基因,而内源性基因中PDI的变化还比部分麦谷蛋白的变化大。进一步证实了储藏蛋白HMW-GS和LMW-GS是影响面筋品质的关键因素。  6.小麦种子基因组的表观遗传学-甲基化的变化,改变了种子的发育,从而影响小麦面筋品质。生物胁迫导致小麦种子成分、含量发生变化的同时,籽粒基因组甲基化模式也发生变化。本研究测定了氮胁迫下与小麦面筋品质密切相关的SDS沉降值变化,并采用MSAP(甲基化敏感扩增多态性技术,methylation sensitive amplification polymorphism)技术比较了,开花后5,8,11,14,16,and21天小麦基因组甲基化的变化。结果显示氮胁迫导致SDS沉降值降低,籽粒总蛋白和HMW-GS(2,12,20)含量降低。氮胁迫诱导开花后8,11,21天小麦种子基因组总的甲基化率升高,其中开花后21天差异最大,达到14.1%。CCGG位点中17.07%-30.99%发生甲基化/去甲基化的变化,其中位点变化最大在开花后第8天。对开花后第8天才发生的甲基化/去甲基化13个差异片段进行克隆并测序。序列同源分析显示,大多数序列参与种子贮藏物质(蛋白质,脂肪)的代谢,还有一些涉及到胁迫应答和生理调节。RT-PCR分析显示去甲基化片段其表达量增加,而甲基化片段则表达受到抑制。表明小麦种子基因组的表观遗传学-甲基化的变化,在氮胁迫下可能影响种子的发育,改变种子的成分、含量最终影响小麦的品质。
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