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低聚龙胆糖（Gentiooligsaccharide）是一类葡萄糖经由β-1,6-糖苷键连接形成的新型功能性低聚糖,包括龙胆二糖、少量的龙胆三糖和四糖,它具有低热量、低甜度的特性和清理肠道的功能,被广泛应用于甜品、饮料行业。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase,简称Bgl）能以葡萄糖为底物,通过逆水解反应制备低聚龙胆糖,然而,产物中除少量纤维二糖、昆布二糖、槐糖等副产物外,基本只含有龙胆二糖,无法检测出三糖及以上聚合度的寡糖。有资料表明,β-1,6-葡聚糖酶（β-1,6-glucanase,简称Bgn16）能以龙胆二糖作为供、受体底物,合成龙胆三糖乃至四糖。本研究通过序列分析、表达验证和定点突变探究了GH3家族β-葡萄糖苷酶逆水解反应机制,确定了影响酶逆水解活性的关键氨基酸。基于上述研究结果,从数据库中挖掘出具备高逆水解活性的Talaromyces cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶TcBgl3A,并选取T.cellulolyticus来源的β-1,6-葡聚糖酶TcBgn16与TcBgl3A协同制备低聚龙胆糖。最后,对重组菌P.pastoris KM71/pPIC9K-tcbgl3a和P.pastoris KM71/pPIC9K-tcBgn16进行3.6L罐高密度发酵,实现了酶的高效制备。主要研究结果如下:（1）从数据库中挖掘了3种不同来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶,并评估了它们逆水解制备龙胆二糖的能力。其中,Talaromyces piceae来源的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A应用效果最好,它能以300 U·g-1葡萄糖的加酶量、在800 g·L-1的葡萄糖溶液中制备出产率最高为15.62%的龙胆二糖。以TpBgl3A为研究对象,围绕+1位受体位点,采用定点突变手段探究了GH3家族β-葡萄糖苷酶的逆水解反应机制。结果显示,Q34G、Q34M及Y200F的二糖总产率分别为22.19%、24.53%和20.52%,其中,龙胆二糖产率分别为17.61%、17.02%和16.62%,较野生型均有不同程度提升。动力学参数表明,在酶的34和200位点引入疏水氨基酸,能够增加酶与葡萄糖糖基受体的亲和力和+1受体位点的疏水性,最终达到提升逆水解活性的目的。（2）基于β-葡萄糖苷酶+1受体位点的优势特征序列,从数据库中获取了具有高逆水解活性、来源于T.cellulolyticus的β-葡萄糖苷酶TcBgl3A。在60℃和pH 4.5的条件下,考察了不同底物浓度和加酶量对TcBgl3A制备龙胆二糖的影响。在800 g·L-1的葡萄糖溶液中,当加酶量为400 U·g-1葡萄糖时,龙胆二糖产率最高达到19.36%,是目前已知报道以葡萄糖为底物单酶制备低聚龙胆糖的最高水平。（3）重组表达T.cellulolyticus来源的β-1,6-葡聚糖酶TcBgn16,并构建TcBgn16与TcBgl3A双酶协同制备低聚龙胆糖的复配体系。在60℃、pH为4.5的条件下,当二者加酶量均为400 U·g-1葡萄糖时,低聚龙胆糖的产率最高可达23.89%。其中,龙胆三糖的产率为4.00%,龙胆二糖与TcBgl3A单酶制备的产率基本持平,说明TcBgn16确实能利用龙胆二糖转苷产生龙胆三糖,并提升低聚龙胆糖的产率。（4）对重组菌P.pastoris KM71/pPIC9K-tcbgl3a和P.pastoris KM71/pPIC9K-tcBgn16进行3.6 L罐高密度发酵水平的初步研究。在诱导温度为25℃、初始诱导菌体浓度OD600为150、甲醇浓度为1.0%的条件下,重组TcBgl3A和TcBgn16酶活最高达到350和1795U·mL-1,分别是摇瓶发酵水平的10.48和6.01倍。