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一、6种MT-MMPs和MMP-2在13株恶性造血细胞株中的表达及其相关性分析目的:检测6种MT-MMPs和MMP-2在13株恶性造血细胞株中的表达谱,并初步探讨恶性血液病中MT-MMPs和MMP-2表达的关系。方法:Alignment程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)比较6种MT-MMPs蛋白序列的同源性,半定量RT-PCR检测13株不同谱系恶性造血细胞株中MT-MMPs和MMP-2的mRNA表达差异,明胶酶谱法分析各细胞株上清中MMP-2的酶活,流式细胞术检测MT1-MMP蛋白的表达。用SPSS 13.0 for Windows分析了各基因的表达与细胞来源的相关性和各基因相互间表达的相关性。结果:属于同一亚类的MT1-,MT2-,MT3-,MT5-MMP氨基酸一致性较高,为53%-65%,其中MT3-、MT5-MMP氨基酸一致性最高为65%,而属于另一亚类的MT4-,MT6-MMP氨基酸一致性较高,为46%。6种MT-MMPs和MMP-2在13株细胞中呈现不同的表达谱,其中MT2-、MT4-、MT1-MMP和MMP-2表达较广泛,而MT3-、MT5-、MT6-MMP在检测的细胞株中较少表达,统计分析显示MT-MMPs和MMP-2的表达与细胞的来源无明显的相关性(P＞0.1),而MT1-MMP和MMP-2(R=0.64,P=0.02),MT3-MMP和MT5-MMP(R=0.57,P=0.04)的表达有相关性;同时还发现MT1-MMP和MMP-2在来源于急性肿瘤的细胞株中表达明显高于来源于慢性肿瘤的细胞株(P＜0.01),相反地,MT4-MMP则在来源于慢性肿瘤的细胞株中的表达较高(P＜0.01),而MT2-MMP在两组细胞株中的表达无明显差异。结论:MT-MMPs在恶性造血细胞中的表达差异,提示它们在不同类型的血液系统肿瘤发展中发挥各自独特的作用。另外,MT1-MMP和MMP-2,MT3-MMP和MT5-MMP之间表达的相关性提示它们在功能上密切相关。二、MT1-MMP瞬时转染HL-60细胞及对其生物学行为的影响目的:构建的MT1-MMP真核表达载体,瞬时转染HL60,初步探讨该基因对HL60细胞增殖、凋亡、侵袭能力和细胞周期等功能的影响。方法:RT-PCR从EAhy926中扩增MT1-MMP全长cDNA,构建pcDNA3.1/V5-His-TOPO-MT1-MMP表达载体;载体经酶切、PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至HL60瞬时表达,RT-PCR,real-time PCR和流式细胞术鉴定转染效果。利用建立的HL60/MT1-MMP细胞为模型,HL60/pcDNA3.1为对照,用MTT法检测细胞的增殖,real-time PCR检测MMP-2、Bcl-2和Bax的表达,Transwell板检测细胞侵袭能力,流式细胞术分析细胞周期。结果:成功构建了MT1-MMP表达载体,real-time PCR和流式细胞术鉴定MT1-MMP能在HL60中获得高效表达。MTT法结果提示转染后HL60/MT1-MMP细胞的增殖能力显著高于对照组(P＜0.01),real-time PCR提示转染后48h转染组和对照组相比MMP-2、Bcl-2和Bax的表达无明显变化,Transwell板检测结果显示转染后48h HL60/MT1-MMP的侵袭能力(15.42±2.38%)显著高于对照组(5.16±0.78%)(P＜0.01),细胞周期分析发现转染后24h,HL60/MT1-MMP G2期和S期比例(67.5±3.57%)高于对照组(57.9±2.52%)(P＜0.05),而转染后48h和72h则两组细胞细胞周期无明显差别。结论:过度表达MT1-MMP的白血病细胞株体外增殖和侵袭能力增强,而其侵袭能力的增强与MMP-2无直接关系,MT1-MMP可能不直接参与调节Bcl-2/Bax介导的细胞凋亡。三、siRNA靶向干扰多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226中MT2-MMP的表达及对其功能影响的初步研究目的:通过RNA干扰降低RPMI8226中MT2-MMP的表达,探讨MT2-MMP对RPMI8226细胞增殖,凋亡,细胞周期和表达血管内皮生长因子及其受体基因的影响。方法:Real-time PCR筛选3对siRNA(siRNA A,siRNA B,siRNA C)24h,48h和72h的干扰效率,流式细胞术鉴定MT2-MMP蛋白水平的干扰。以有效干扰的siRNA通过脂质体转染RPMI8226,建立MT2-MMP瞬时沉默细胞模型,以无关siRNA转染RPMI8226组作为对照,MTT法检测细胞的增殖,real-time PCR检测Bcl-2,Bax及VEGF-A,B,C,D,PIGF,VEGFR1和VEGFR2基因的表达,Transwell板检测细胞侵袭能力,流式细胞术分析细胞周期。结果:3对siRNA中siRNA C转染后48h的干扰效率最高,8226/siRNA C细胞中MT2-MMP的mRNA表达量为对照组的0.03倍,而蛋白表达量约下降70%,成功建立了MT2-MMP表达瞬时沉默的细胞模型。MTT法结果提示干扰组细胞增殖能力明显降低(P＜0.01),real-time PCR提示48h干扰组和对照组Bcl-2和Bax,表达量无明显变化,两组细胞均不表达VEGF-C,PIGF,VEGFR1,两组细胞VEGF-B的表达量无明显差异,而干扰组VEGF-A和VEGFR2的表达量分别为对照组的2.02倍和4.95倍。Transwell板检测结果显示干扰48h后8226的侵袭能力与对照组相比无明显差异。细胞周期分析发现干扰后24h,48h,72h,8226/siRNA C G2期和S期比例分别为45.8±4.27%,43.0±2.62%,55.0±4.11%;对照组G2期和S期比例分别为57.7±3.49%,49.8±3.26%,65.2±4.67%,另外72h干扰组还检测到凋亡细胞比例为6.3±0.31%,对照组凋亡细胞比例仅为1.6±0.20%。结论:MT2-MMP能促进体外骨髓瘤细胞株的增殖,而对其体外侵袭能力无明显影响。MT2-MMP基因沉默可通过直接或间接途径上调VEGF-A和VEGFR2基因的表达。四、RT-PCR分析人微血管和大血管内皮细胞株中6种MT-MMPs的表达差异目的:分析微血管和大血管内皮细胞株中MT-MMPs的表达差异,以探讨MT-MMPs在内皮细胞中的作用。方法:半定量RT-PCR检测6种MT-MMPs人微血管内皮细胞株HMEC-1、人脐静脉内皮细胞株ECV304和EAhy926中的mRNA表达。结果:6种MT-MMPs在3株不同细胞中呈现不同的表达谱。HMEC-1中MT1-和MT2-MMP表达量较高;ECV304中MT2-和MT4-MMP表达量较高,EAhy926中MT1-和MT4-MMP表达量较高。结论:MT-MMPs在不同血管内皮细胞株中的表达差异,可能与各内皮细胞株不同的来源、表型特点和各自具有不同的功能有关。五、MT1-MMP、MMP-2和TIMP-2在内皮细胞株中的表达及意义目的:为探讨MT1-MMP在血管生物学中的作用,本研究比较了MT1-MMP及功能相关的MMP-2和TIMP-2在人微血管内皮细胞株HMEC-1和人大血管内皮细胞株EAhy926、ECV304中的表达差异。方法:Real-time PCR检测3株内皮细胞株中MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2的mRNA表达,流式细胞术检测MT1-MMP的蛋白表达,明胶酶谱法分析细胞株上清中MMP-2的酶活。结果:Real-time PCR分析显示3株细胞均表达MT1-MMP与TIMP-2,MT1-MMP在EAhy926中表达最高,TIMP-2在ECV304中表达最高,而仅在EAhy926中检测到MMP-2的高表达。流式细胞检测和明胶酶谱结果与PCR分析一致。结论:MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2在3株内皮细胞株中表达谱的特点,符合MT1-MMP的调节机制,而MT1-MMP和MMP-2在典型的大血管内皮细胞株EAhy926中高表达,其具体机制有待进一步研究。