传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)属双RNA病毒家族成员,它主要侵害雏鸡体液免疫中枢器官法氏囊中的B淋巴细胞前体,导致严重的免疫抑制。由于其基因组较小,编码蛋白少,常被作为dsRNA的模式病毒进行研究。目前,对IBDV各病毒蛋白的生物学功能已有一定的了解,但是从细胞分子水平分析病毒蛋白间的相互作用、病毒与宿主相互关系的研究相对较少,而这些对于IBDV复制机制和致病机理的阐明具有重要意义。本研究以IBDV感染的宿主细胞为主要研究对象,采用荧光双标法分析感染细胞内各病毒蛋白的亚细胞定位关系,采用差异蛋白质组学方法对IBDV感染细胞的蛋白代谢变化进行了探索,并选择重要的差异表达蛋白开展深入的功能研究。VP1是IBDV基因组B节段编码的一种RNA依赖的RNA聚合酶,在基因组RNA的复制和病毒粒子的组装过程中发挥重要的作用。本研究采用长距离RT-PCR方法扩增了IBDV细胞适应毒NB株基因组B节段全长cDNA,将其编码框VP1基因亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,经IPTG诱导,表达了分子量约为97kDa的VP1融合蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在,在体外容易发生降解。以镍柱亲和纯化的重组VPl蛋白为免疫原,制备获得4株抗IBDV-VP1的特异性鼠单克隆抗体和兔多抗血清,为深入开展IBDV复制机理研究提供了有用的抗体工具。以VP1的特异性抗体为工具,分析了pEGFP-VP1和pCI-neo-VP1真核表达质粒转染细胞以及IBDV感染细胞中VP1的表达分布情况。转染细胞内单独表达VP1及EGFP-VP1融合蛋白均以弥散状分布于胞浆内；IBDV感染细胞内,感染早期VP1主要以弥散状分布于胞浆内,感染晚期VP1聚集成大小不等的颗粒状散在分布于胞浆内。这表明VP1是一种胞浆内分布蛋白,弥散和颗粒状分布的VP1发挥不同的生物学功能,其颗粒结构与病毒复制过程有关。以VPl抗体为工具,采用荧光双标法分析VP1与衣壳蛋白VP2和VP3、丝氨酸蛋白酶VP4以及非结构蛋白VP5在鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts, CEF)和Vero细胞两种宿主细胞中的亚细胞定位关系。结果显示,VP1、VP2、VP3和VP5在两种细胞中的表达模式基本相同,而VP4在两种细胞中有不同的表达分布特征。其中,VP2以弥散和颗粒状分布于胞浆内,VP2颗粒比VP1大,数量比VP1少,与VP1的部分颗粒有信号重叠的现象,提示该区域可能是病毒组装的场所。与VP1相似,VP3也在胞浆内形成颗粒状结构,与VP1表现为共定位的现象,这与现有文献报道的VP1和VP3形成稳定复合物参与IBDV组装过程的结论相佐证。弥散状聚集在胞膜上的VP5与胞浆分布的VP1不存在共定位关系,表明VP5和VP1在IBDV感染过程中发挥不同的生物学功能。不同于VP1、VP2、VP3和VP5,VP4在感染细胞的胞浆和核内均有分布。在不同宿主细胞核内,VP4均形成长短不等的针状结构,在胞浆内则不同,VP4以针状结构交织成网状分布在CEF的胞浆内,以团块状结构分布于Vero细胞的胞浆核周区,胞浆内VP4信号较弱的部位则是VP1颗粒聚集的区域。进一步采用荧光双标法分析VP2、VP3和VP4在IBDV感染的鸡胚成纤维细胞系DF-1中的表达定位关系。观察发现,随着病毒感染周期的不同,VP2、VP3和VP4的表达分布模式在逐渐转变。其中,胞浆分布的VP2由弥散状逐渐聚集为颗粒状和针状结构,胞浆内的VP3也由弥散状聚集为颗粒状或中空的团块状结构；胞浆和核内分布的VP4的变化趋势相同,均呈现有弥散状→点针状→短针状→长针状和颗粒状的变化动态,其中颗粒状结构只出现在胞浆内。从定位关系看,胞浆内颗粒状和针状的VP2与VP4表现为共定位,提示在感染晚期VP2和VP4存在相互作用关系,这可能与VP4对pVP2的二次剪切即VP2的加工成熟过程有关；颗粒状的VP2和VP4大多分布在中空的团块状VP3中央,提示,这些颗粒状或团块状结构所在的区域是病毒复制组装的关键部位,病毒的复制组装主要发生在“病毒工厂”的周围区域,而病毒粒子的加工成熟则发生在“病毒工厂”中央。VP4的核内分布提示,VP4除了加工剪切多聚蛋白和VP2前体蛋白外,可能还与宿主细胞发生相互作用,在IBDV的致病中起作用。为了从细胞分子水平大规模地分析病毒与宿主细胞的相互作用关系,.本研究采用二维凝胶电泳结合质谱鉴定的差异蛋白质组学研究方法,以IBDV的易感细胞CEF为感染模型,分析IBDV感染CEF后12h、48h和96h三个不同时间细胞蛋白的表达变化动态。二维凝胶的差异表达分析显示,CEF在感染IBDV后,共有102个蛋白点出现了显著的差异表达,蛋白表达变化主要发生在感染后48h和96h。采用MALDI-TOF/TOF质谱法对102个差异表达蛋白点进行质谱鉴定,结果成功鉴定81个蛋白点(对应51种细胞蛋白),包括13种上调蛋白和38种下调蛋白。这些差异蛋白分别代表IBDV感染诱导过量表达的多聚泛素、载脂蛋白A-1、27kDa热激蛋白1、肌动蛋白、微管蛋白、真核翻译起始因子4A异构体2 (EIF4A2)、酸性核糖体磷蛋白和核糖体相关蛋白,以及IBDV感染抑制表达的参与泛素介导的蛋白降解、糖代谢、中间丝、mRNA翻译和信号转导的细胞蛋白。实时RT-PCR在转录水平上验证了质谱鉴定的38个差异表达蛋白对应基因的变化情况,确证了质谱鉴定的准确性。借助Western blot分析,应用单克隆抗体在蛋白水平上进一步确认了IBDV感染细胞中Rho蛋白解离抑制因子的表达抑制和多聚泛素的诱导表达。以上结果表明,IBDV感染主要引起了细胞内细胞骨架网络、应激反应、泛素-蛋白酶体通路、大分子合成、细胞代谢和信号转导通路的变化,这些数据为进一步研究IBDV感染的机制和致病机理提供了有用的蛋白质相关基础信息。基于IBDV感染细胞的蛋白质组学分析发现,IBDV感染诱导了宿主细胞内多种细胞骨架相关蛋白的表达变化,为了进一步分析IBDV感染对宿主细胞骨架的影响,以VPl抗体为工具,采用间接免疫荧光技术定位IBDV感染细胞,同时以F-actin特异性探针FITC-phalloidin标记微丝、抗β-tubulin和vimentin抗体标记微管和中间丝,采用荧光双标技术分析IBDV感染细胞中微丝、微管和中间丝三种骨架的亚细胞结构变化。结果显示,三种细胞骨架结构在IBDV感染细胞中均发生了特征性的变化,其中,以中心体为中心呈放射状分布的微管结构在IBDV感染后期部分或完全被破坏,胞浆内致密的vimentin中间丝骨架结构在感染后也被破坏；而微丝F-actin在感染细胞中则异常聚合,表现为在核内形成针状结构,在Vero细胞胞浆内以块状结构分布在胞浆核周区,在CEF胞浆内以针状结构交织分布。IBDV感染细胞中F-actin的表达分布变化与VP4非常相似,提示两者可能存在相互关系,因此进一步采用荧光双标技术对F-actin和VP4进行亚细胞定位关系分析。结果显示,在IBDV感染的不同宿主细胞(CEF、Vero细胞和法氏囊组织细胞)的胞浆核周区和胞核内均出现了F-actin与VP4共定位现象；而在VP4真核表达载体转染细胞中,VP4仅分布在胞浆内,且在VP4分布的区域F-actin的荧光信号更强,表现为部分共定位现象。以上结果提示,IBDV感染细胞中VP4可能与F-actin发生相互作用,核内出现的针状F-actin及针状VP4与IBDV感染有关。为了进一步分析IBDV感染细胞内VP4与F-actin的相互关系,将IBDV感染细胞用Triton X-100进行处理,分别以VP4和β-actin单抗对Triton X-100可溶成分进行免疫共沉淀分析,结果发现在可溶上清中只含少量VP4,且与β-actin单体没有相互结合关系；但在TritonX-100不溶性细胞骨架成分中检测到大量VP4,提示VP4可能与不溶性的F-actin骨架结合在一起,从而以Triton X-100不溶形式存在。为了初步探讨F-actin在IBDV感染细胞中的生物学功能,用F-actin的聚合抑制药物细胞松弛素D (cytoD)作用IBDV感染的细胞,借助TCID50测定对比药物处理前后病毒的产量和细胞上清中的病毒滴度,结果显示,中低浓度的cytoD处理显著降低病毒产量,细胞上清中的病毒滴度也明显下降,表明F-actin的解聚影响了IBDV感染性病毒粒子的产生以及病毒粒子的释放过程。作为一种胞浆复制病毒,核内出现VP4和F-actin提示VP4除了加工剪切多聚蛋白和VP2前体蛋白外,还可能与宿主细胞发生相互作用发挥功能。因此,进一步对VP4和F-actin的入核机制、互作机制以及在IBDV感染过程中的生物学功能等问题进行深入探讨,将为IBDV的复制机制和致病机理研究提供重要的线索。