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血管内皮细胞可维持血管的功能和结构的稳定,当血管内皮细胞受损时可诱导动脉粥样硬化、血管炎、脓毒症患者微循环障碍及血管损伤相关的糖尿病综合征等疾病。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)为革兰氏阴性菌的细胞壁成分,又称为内毒素。全身感染细菌后,脂多糖一般不直接损伤组织细胞,而是通过诱导巨噬细胞、中性粒细胞、血小板等组织细胞释放TNF-α等细胞因子,引起血管内皮细胞损伤,目前对革兰氏阴性菌感染患者血液中释放的脂多糖促进TNF-α的诱生而造成血管内皮细胞损伤及细胞自我保护的具体分子机制尚不明确。本研究选择人脐静脉血管内皮细胞HUVECs为模型,探讨mTORC1调控TNF-α诱导细胞的凋亡与自噬的作用及调控机制,试图为阐明革兰氏阴性菌感染导致血液中TNF-α水平升高,使血管内皮细胞受损的机制提供新的佐证。主要结果如下:1.酶联免疫吸附法检测血管炎患者血清及LPS诱导的人巨噬细胞培养上清中的TNF-α的含量。结果显示:(1)血管炎患者血清中TNF-α的含量高于健康体检者血清(p<0.01)。(2)LPS诱导的人巨噬细胞培养液中TNF-α的含量明显升高(p<0.05)。2.利用MTT法、Hoechst 33342染色、Western blot法、荧光分光光度计法及流式细胞术等方法检测TNF-α诱导人脐静脉血管内皮细胞HUVECs增殖和凋亡情况,并确定TNF-α诱导HUVECs发生凋亡的途径及其信号通路。结果显示:(1)TNF-α能够显著抑制HUVECs增殖,并具有浓度和时间依赖性;(2)TNF-α能够诱导HUVECs发生凋亡;(3)TNF-α诱导HUVECs高表达死亡受体TNFR1、Fas相关死亡结构域蛋白FADD,Caspase 8和Caspase 3蛋白表达显著减少,Caspase 8、Caspase 3的酶活明显上升(p<0.01);Caspase 9的蛋白表达量及酶活与对照相比却没有显著性变化(p>0.05);(4)抗体封闭膜受体TNFR1,封闭组与未封闭组相比,TNF-α诱导的HUVECs内TNFR1和FADD表达降低,Caspase 8和Caspase 3总蛋白水解减少;(5)TNF-α诱导HUVECs中MyD88的表达升高,而TIRAP的表达却不受TNF-α诱导的影响。上述结果表明:TNF-α通过死亡受体途径诱导HUVECs发生凋亡;HUVECs通过膜受体TNFR1识别TNF-α,并诱导MyD88高表达。3.利用MDC染色和Western blot方法检测TNF-α诱导人脐静脉血管内皮细胞HUVECs是否发生自噬。结果表明:(1)TNF-α诱导后HUVECs细胞浆中自噬小泡增多;(2)TNF-α诱导后Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,表明TNF-α可诱导HUVECs发生自噬。4.利用RNA干扰技术靶向沉默BECN1、Bcl-2、DAP1、IRF1、ATG5和ATG12,并确定上述基因对TNF-α诱导HUVECs凋亡和自噬平衡和转换的调控作用。结果显示:(1)靶向siRNA可以沉默HUVECs中的BECN1、Bcl-2、DAP1、IRF1、ATG5和ATG12的基因表达。其中沉默BECN1和Bcl-2后,TNF-α诱导的HUVECs自噬减少,凋亡增加;(2)BECN1基因沉默后TNF-α处理组和对照组比较,剪切的PARP增多,Pro-Caspase 3水解增多,促进TNF-α诱导的凋亡;而Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值减少,MDC染色显示细胞浆中自噬小泡减少,自噬被抑制;(3)Beclin1激动剂PPX处理1 h后TNF-α处理12 h组和对照组比较,Western blot方法检测剪切的PARP减少,Pro-Caspase 3变化不明显,凋亡被抑制;而Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,促进自噬。上述结果表明,Beclin1蛋白调节TNF-α诱导HUVECs的凋亡与自噬的平衡或转换,促进自噬,抑制凋亡。5.qPCR方法及Western blot方法检测mTORC1对BECN1的调控作用,结果表明Rapamycin促进TNF-α诱导的Beclin1的表达,Rheb过表达致使Beclin1表达减少。上述结果表明,Beclin1表达受mTORC1调控。6.靶向沉默p53,Western blot方法检测Beclin1蛋白的表达,p53沉默后降低TNF-α诱导的Beclin1蛋白表达,表明转录因子p53参与BECN1表达。用Rapamycin处理可促进TNF-α诱导的p53蛋白表达,Rheb过表达抑制p53蛋白表达,说明mTORC1调控p53表达。预示mTORC1可能通过转录因子p53来调节BECN1表达。综上,TNF-α可以抑制HUVECs增殖,通过死亡受体途径诱导其凋亡,转导通路为MyD88依赖型;TNF-α也可以诱导HUVECs发生自噬,自噬的发生是mTORC1依赖型。mTORC1信号通路通过转录因子p53调节BECN1表达,控制Beclin1蛋白合成,进而调控TNF-α诱导HUVECs的自噬与凋亡,维持细胞稳态。实验所获得的数据对了解TNF-α诱导血管内皮细胞损伤及细胞自我保护机制提供了新的佐证,为阐明革兰氏阴性菌感染而导致的血管内皮受损及由血管内皮细胞损伤而引发的动脉粥样硬化、血管炎、血管损伤相关的糖尿病综合征等相关疾病的预防提供了新的思路。