鸭坦布苏病毒的分离、致病性及细胞适应研究

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2009年底,在我国南方部分养鸭集中的地区出现一种使产蛋鸭发生卵巢出血、产蛋量迅速下降的疾病,雏鸭感染后多产生神经症状,严重者会出现死亡现象。该疾病广泛传播,迅速蔓延至福建、浙江、江苏、江西、广东、广西、安徽、山东、河南、河北、北京等地区,给我国养鸭业造成巨大经济损失。经大量的实验证实该病是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)引起。本实验从山东发病鸭场的病料中分离出3株鸭坦布苏病毒,分别命名为Du/CH/LSD/110128、Du/CH/LSD/110130和Du/CH/LSD/101101。首先,对该3株病毒与其他黄病毒代表毒株进行基因同源性分析和遗传进化树构建,发现具有较近的亲源关系。选取Du/CH/LSD/110128进行进一步实验。病毒基因组为单股正链RNA,含有一个由10278个核苷酸组成的ORF,编码一个由3425个氨基酸组成的多聚蛋白,基因组的编码顺序为结构蛋白C、PrM、E和非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2K、NS4B、NS5。选取7日龄SPF雏鸭用Du/CH/LSD/110128进行攻毒试验,分别采用脑内注射、腿静脉注射和肌肉注射滴鼻点眼结合3种不同的接种途径,脑内注射组与腿静脉注射组患病鸭出现明显神经症状角弓反张、共济失调步态、反应迟缓等,并出现死亡,发病率均达到100%,死亡率分别为18.2%和5.3%,而肌肉滴鼻点眼组未发病。结果表明脑内注射是使病毒在鸭体内迅速繁殖的最好方式,腿静脉注射效果稍差。此外,雏鸡攻毒试验采用脑内注射为接种途径对7日龄SPF雏鸡进行攻毒,发病率达到30%,未发生死亡。成年鸭攻毒试验选取60日龄SPF成年鸭,分别采用脑内注射和腿静脉注射2种不同接种途径,脑内注射发病率达到50%,腿静脉注射发病率在25%左右,以此两种途径接种均不造成成年SPF鸭死亡。表明该病毒致鸭发病具有明显的日龄依赖性。此外,以Du/CH/LSD/110128鸭胚原代尿囊毒进行了Vero E6细胞与BHK-21细胞的适应研究,结果显示Du/CH/LSD/110128株可在Vero E6细胞和BHK-21细胞上稳定增殖并传代。接种Vero E6细胞第一代时即产生CPE,在传代继续进行的过程中CPE逐渐不明显,当病毒继续向下传代至第6代时CPE完全消失。Du/CH/LSD/110128接种BHK-21细胞在第1代时产生明显CPE,在传代继续进行的过程中CPE逐渐不明显,传至第5代时CPE已很难观察到,直至到第8代CPE完全消失。但在2种细胞上均可捡到病毒。由于黄病毒科大部分病毒均为人兽共患病病毒,所以不排除鸭坦布苏病毒在自然条件下可传播变异感染哺乳动物。为了验证这一观点,我们用Du/CH/LSD/110128株对4-6周龄BALB/c小鼠脑内注射进行人工感染。病毒在BALB/c小鼠脑中已传至第4代后检查不到病毒,说明该病毒对小鼠不易感。
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