论文部分内容阅读
研究背景和目的:蛋白质分子在其脯氨酸前的丝/苏氨酸模体(pSer/Thr-Pro motifs)的磷酸化是细胞增殖和转化的主要信号调节机制。最近的研究发现蛋白质分子在其脯氨酸前的丝/苏氨酸模体存在两种截然不同的构象,即顺式和反式。这两种构象转化速度,在磷酸化过程中被显著的减慢,但却可以被肽基脯氨酰同分异构酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase, Pin1)所特异性催化。这种由Pin1所催化的构象变化能对许多磷酸化信号途径产生影响,因此在不同的细胞进程中发挥着重要作用。越来越多的研究证实Pin1在一些人类疾病的发病中起着重要角色,推测Pin1介导的磷酸化后调节可能为阻断致癌途径提供一个独特的思路。我们的前期研究也发现在宫颈癌组织是高表达的,因此,我们设想抑制宫颈癌中的Pin1的表达是否也可以阻断肿瘤发生发展?本课题带着这个问题,探讨了干扰Pin1基因的表达是否在宫颈癌可以阻断肿瘤的生物学行为,阻遏肿瘤的发生发展,为宫颈癌的临床治疗提供有价值的补充。研究方法:一、体外水平,选取宫颈癌SiHa细胞,实验分为三组SiHa/Pin1-si转染组,SiHa/Con-si空载体对照组和SiHa空白对照组:1.构建Pin1小干扰RNA质粒,转染宫颈癌SiHa细胞并采用RT-PCR和western blot技术检测Pin1基因的干扰效果;2. MTT法检测转染了Pin1小干扰RNA质粒的SiHa细胞增殖活性的改变以及对化疗药物顺铂的敏感性;3. TUNEL、Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测细胞的凋亡改变;4. MTT比色法检测细胞对细胞外基质的粘附能力;5. Transwell侵袭小室测定法检测细胞侵袭能力的改变;6.体外迁移实验检测细胞迁移能力的变化;7. Western blot检测VEGF和MMP-2的表达的变化;8.明胶酶谱法检测MMP-2的活性改变。二、在体水平,选取4-6周龄的雌性BALB/C裸小鼠成功构建宫颈癌SiHa细胞的裸鼠移植瘤模型后,设Pin1-siRNA治疗组,Con-siRNA和PBS治疗组:1.观察裸鼠移植瘤的生长情况,每周检测体积2-3次,比较移植瘤的体积和重量;2. Western blot检测瘤体内MMP-2和VEGF的蛋白表达水平;3.免疫组化检测瘤体以及肺、肾、心脏组织中的MMP-2和VEGF的蛋白表达强弱。结果:在体外和体内水平上,干扰Pin1的表达可以抑制宫颈癌细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,提高细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤血管生成以及粘附侵袭和迁移能力等肿瘤的生物学行为。结论:Pin1可能在宫颈癌的发生发展中起到重要作用,它为宫颈癌的治疗可能提供了一个有效的分子靶点,阻断Pin1表达为宫颈癌的临床治疗提供了一个独特的思路。