内蒙古额吉淖尔盐碱湖嗜盐古菌的分离及其bop基因克隆

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:yanghao_haohao
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一些生物可以生长在极端环境中。极端环境包括:高温、寒冷、高压、高盐、强碱、强酸、高辐射等环境。能够在这样的环境中栖息生长的微生物,称为极端环境微生物。能够在高盐度环境中生长的嗜盐古菌由于其特殊的适应力使其成为研究生物对环境的适应及生理和生化特性的良好的素材。另外,其特殊的酶以及其他大分子产物在食品工业、医药行业、环境整治与其它化学工业等方面,都具有较好的应用潜力。在嗜盐古菌的紫膜中含有与视觉中视紫红质相似性很高的蛋白质,即细菌视紫红质。细菌视紫红质(bacteriorhodopsin, BR)存在于古细菌的紫膜,是由bop基因编码的唯一蛋白质。在光照条件的情况下,BR可以通过其质子泵的作用,将质子从膜内泵向膜外,产生跨膜质子梯度,从而原始光能转化为电势能,这种转化能量的方式可以为其生命活动提供所需要的能量。BR蛋白材料具有良好的稳定性,而且是一种绿色的生物功能材料,对环境不会造成污染,所以具备良好的应用前景。本研究从内蒙古额吉淖尔湖取土样,用选择性培养基分离得到一株产视紫红质的极端嗜盐古菌。然后通过对其16S rDNA测序对该菌株进行了分子鉴定,在NCBI数据库中BLAST搜索该序列并进行比对,初步鉴定该菌株属于Natrinema属。以该嗜盐古菌的基因组DNA为模板,根据细菌bop基因序列设计了引物,PCR扩增得到含有细菌视紫红质bop基因的片段,进行了测序。序列分析表明克隆得到的DNA片段全长为385bp。把bop基因克隆到表达载体pET-28a,构建了表达细菌视紫红质的重组表达载体,并命名为pET-28a-B。 bop基因核心序列分析显示,bop基因包含一个303bp的开放阅读框,编码101个氨基酸。Blastp结果表明该蛋白属于Bac-rhodopsin蛋白家族,具有典型的细菌视紫红质蛋白结构域。利用BLAST进行相似性分析发现bop编码蛋白氨基酸序列与Genbank中编号AAS87571.1、 WP-007110705和AFB77278.1的视紫红质蛋白相似性达到98%以上。该bop基因已在Genbank中注册,编号为KF863690。此结果表明该视紫红质蛋白在细菌及古菌中结构上具有很高的保守性,与其质子泵功能紧密相关。本研究分析了该菌株的最适生长条件。该菌株在分离培养基中适宜生长的NaCl浓度范围为1.0-3.0mol/L,适宜生长pH为6.5-8.5,适宜生长镁离子浓度为0.4-0.8mol/L。通过不同梯度条件分析比较菌株的生长结果,得出该嗜盐古生菌株在NaCl中生长的最适浓度为1.5mol/L,最适pH为7.5,在镁离子中的最适生长浓度为0.4mol/L。结果显示该菌株为中度嗜盐菌。该实验结果为今后进一步研究产视紫红质的极端嗜盐古生菌株的生理生化特征及遗传学特征奠定了良好的基础。
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