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帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大常见的中枢神经系统退行性疾病，病因和发病机制极其复杂，可能与遗传因素、年龄老化、环境因素及神经炎症等密切相关。PD主要病理改变是路易小体形成和黑质纹状体系统多巴胺(dopamine，DA)能神经元的丢失。越来越多的证据表明，神经元损伤与胶质细胞炎症反应之间形成的恶性循环，加重了神经元的损伤和退化。因此通过抑制神经炎症保护DA能神经元是PD治疗的一条有效途径。
胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)主要由肝脏合成，脑内神经元和神经胶质细胞亦可合成，是一种神经营养因子。研究发现，成年后随着年龄的增加，外周血液中IGF-1的含量逐渐下降，此变化可能与PD、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神经退行性疾病的发病有关。虽然研究发现IGF-1具有神经保护作用，可通过IGF-1受体(IGF-1 receptor，IGF-1R)介导的信号途径发挥其对脑细胞的功能调控，但是IGF-1在脑内的作用仍有争议。因此阐明IGF-1抗PD神经元凋亡和炎症反应的分子机制具有重要的科学意义。
研究证实IGF-1与雌激素相互作用能够促进大脑发育、突触传递及神经元的存活和分化。IGF-1R和雌激素受体(estrogen receptor，ER)在神经元和神经胶质细胞共表达。IGF-1R主要表达在神经元和星形胶质细胞(astrocyte，AS)，是IGF-1神经保护作用的靶点。G蛋白耦联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor，GPER)是2005年Revankar等在science上首次报道的雌激素膜受体，主要介导雌激素的快速非基因组作用。激活的GPER能够对抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine, MPTP )诱导的DA能神经元的凋亡和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症反应，发挥神经元保护功能。最近，在乳腺癌和子宫内膜癌细胞的研究中发现，IGF-1可通过IGF-1R/PKC/MAPK信号通路调控癌细胞GPER的表达，促进癌细胞的增生。那么在中枢神经系统，我们提出IGF-1是否通过神经元和AS细胞膜表面IGF-1R介导的信号途径对抗神经毒素MPTP对黑质纹状体系统DA能神经元的损伤？GPER是否参与IGF-1的抗炎和抗凋亡作用?
本研究第一部分在整体动物水平，小鼠腹腔注射MPTP制备PD模型，探讨IGF-1是否能够通过IGF-1R介导的信号途径，发挥其抗炎和抗凋亡的神经保护作用，GPER是否参与其中。第二部分应用DA能神经细胞SH-SY5Y，1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium，MPP+)制备PD细胞模型，探讨IGF-1R和GPER是否参与IGF-1抗凋亡的神经保护作用。第三部分应用原代培养AS，MPP+诱导炎症反应，采用药理阻断和siRNA干扰技术探讨IGF-1R和GPER是否参与IGF-1的抗炎作用，并探讨IGF-1对AS的功能活动调控。
1.IGF-1对MPTP诱导的PD小鼠模型神经保护作用及分子机制研究
腹腔注射MPTP制备PD小鼠模型，侧脑室注射IGF-1、IGF-1R特异性阻断剂JB-1及GPER特异性阻断剂G15，应用行为学检测、免疫组织化学技术、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、实时荧光定量PCR(realtime PCR， RT-PCR)及免疫印迹技术(western blot)等，探讨IGF-1神经保护作用的分子机制。实验结果如下：
(1)免疫组化的结果显示，GPER在黑质区广泛表达。
(2)爬杆实验和转棒实验结果表明，IGF-1能够明显改善MPTP诱导的小鼠运动障碍(P<0.05，P<0.001)，此作用可被JB-1或G15所阻断(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。旷场实验结果显示，IGF-1明显增加小鼠的运动距离和平均速度(P<0.01，P<0.05)，此作用可被JB-1阻断(P<0.01)，G15有部分阻断作用，但无统计学意义。
(3)HPLC结果显示，IGF-1能够改善MPTP引起的纹状体DA及其代谢产物含量的降低(P<0.001，P<0.01)，此作用可被JB-1和G15阻断(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。(4)与MPTP组相比，IGF-1能够提高黑质区致密带TH-ir神经元的存活数目(P<0.05)。JB-1和G15能够抑制IGF-1的作用(P<0.01，P<0.05，P<0.001)。在TH蛋白水平，结果与此一致。
(5)IGF-1具有抗凋亡作用，能够逆转MPTP诱导的Bax和Bcl-2蛋白表达的变化(P<0.05)。IGF-1对Bax蛋白的调控作用只能被JB-1阻断(P<0.01)，而IGF-1对Bcl-2蛋白的调控作用可以被JB-1和G15所阻断(P<0.001)。
(6)为探讨MPTP是否通过活化的AS，促进PD的病理进程，本实验应用免疫荧光和westernblot技术，检测了AS的特异性标志物胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达。结果显示，IGF-1能够抑制MPTP诱导的GFAP表达的升高(P<0.05)，且IGF-1单用能够促进AS的增殖(P<0.01)。
(7)进一步的实验证实，IGF-1能够抑制MPTP诱导的TNF-α，IL-1β，COX-2和iNOSmRNA表达的升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，JB-1和G15能够阻断IGF-1的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。在蛋白水平，IGF-1显著抑制COX-2和iNOS蛋白表达的上调(P<0.001，P<0.05)，此作用可以被JB-1和G15所阻断(P<0.01，P<0.05)。
在整体动物水平，IGF-1可通过IGF-1R介导的信号途径抑制MPTP诱导的神经元的凋亡和AS的炎症反应，且GPER参与了IGF-1对黑质纹状体系统DA能神经元的保护作用。
2.IGF-1对抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的分子机制研究
采用MPP+处理SH-SY5Y细胞制备PD离体细胞模型，探讨IGF-1在离体细胞水平抗凋亡作用的分子机制。结果如下：
(1)不同浓度的IGF-1(12.5、25、50、100 ng/ml)能明显对抗MPP+的神经毒性，提高细胞活力(P<0.05，P<0.01)。
(2)不同浓度的IGF-1(25，50，100 ng/ml)能够抑制MPP+诱导的Bax蛋白表达的上调(P<0.001，P<0.05，P<0.01)及Bcl-2蛋白表达的下调(P<0.05，P<0.01)，JB-1和G15均能阻断IGF-1的抗凋亡作用(P<0.05，P<0.01)。
(3)IGF-1可明显抑制MPP+诱导的线粒体膜电位的降低(P<0.01)。JB-1可阻断IGF-1的此作用(P<0.05)。G15能部分阻断IGF-1的保护作用，但无统计学意义。
(4)单用IGF-1可以明显增加Akt和ERK的蛋白磷酸化水平，上调GPER蛋白表达，且具有时间依赖性(P<0.05，P<0.01)。
(5)JB-1、PI3-K拮抗剂LY294002或MEK拮抗剂PD98059可分别抑制IGF-1对Akt或ERK的磷酸化和GPER蛋白表达的上调(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。
在离体细胞水平，IGF-1R介导IGF-1抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的损伤，保护DA能神经元，GPER参与IGF-1的抗凋亡作用。IGF-1能够促进GPER蛋白的表达，此作用与PI3-K和MAPKs信号通路有关。
3.IGF-1对MPP+诱导的原代星形胶质细胞炎症反应的抑制作用机制研究
本实验采用MPP+建立原代AS炎症反应模型，应用RT-PCR、westernblot、免疫细胞荧光及siRNA干扰等实验技术，探讨IGF-1抗炎作用的分子机制及其对原代AS功能活动的影响。实验结果如下：
(1)GPER和IGF-1R与GFAP在AS共表达。
(2)不同浓度的IGF-1(12.5，25，50，100 ng/ml)可抑制MPP+诱导的COX-2和iNOS蛋白表达(P<0.01，P<0.05)。JB-1和G15能够阻断IGF-1对COX-2和iNOSmRNA和蛋白表达的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。
(3)MPP+能够明显促进P38、JNK和IκB的蛋白磷酸化(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。JB-1预处理能够阻断IGF-1对P38、JNK和IκB蛋白磷酸化的抑制作用(P<0.05，P<0.01)，G15可阻断IGF-1对JNK和IκB磷酸化的抑制作用(P<0.01)，但不能阻断IGF-1对p38的磷酸化抑制作用(P>0.05)。
(4)不同浓度的IGF-1(6.25，12.5，25，50和100ng/ml)单用能够明显增加谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1，GLT-1)和谷氨酸-天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter，GLAST)mRNA的表达(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，但100ng/mlIGF-1对GLT-1的基因表达没有影响。此作用可被阻断剂JB-1、G15、LY294002及PD98059所阻断(P<0.05，P<0.01)。
(5)IGF-1可明显促进Akt和ERK的磷酸化，且具有时间依赖性(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。JB-1、LY294002或PD98059可分别抑制IGF-1对Akt或ERK的蛋白磷酸化作用(P<0.05，P<0.001)。
(6)IGF-1能够时间依赖性上调c-fosmRNA及GPERmRNA和蛋白表达(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，此作用可被JB-1，LY294002或PD98059阻断(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。(7)siRNA干扰GPER的基因表达后，IGF-1对MPP+诱导的COX-2及iNOS基因和蛋白表达的抑制作用显著减弱(P<0.01，P<0.001)。
(8)siRNA干扰GPER的基因表达后，IGF-1对GLT-1和GLASTmRNA的诱导作用亦明显被抑制(P<0.01)。
GPER参与IGF-1对抗MPP+诱导的原代AS的炎症反应，通过抑制MPP+诱导的MAPKs、NF-κB信号通路激活，减少炎症因子的释放。进一步研究揭示GPER参与了IGF-1对原代AS功能活动的调节，IGF-1能够促进GPER蛋白和基因的表达，此作用与PI3-K/Akt和MAPKs/c-fos信号通路有关。
结论：IGF-1通过激活IGF-1R信号途径，抑制MPTP/MPP+诱导的神经元凋亡和AS的炎症反应，保护DA能神经元，雌激素膜受体GPER参与了IGF-1的神经保护作用。IGF-1能够调节中脑GPER基因和蛋白的表达，此作用可能与PI3-K/Akt和MAPKs/c-fos信号通路有关。
胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)主要由肝脏合成，脑内神经元和神经胶质细胞亦可合成，是一种神经营养因子。研究发现，成年后随着年龄的增加，外周血液中IGF-1的含量逐渐下降，此变化可能与PD、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神经退行性疾病的发病有关。虽然研究发现IGF-1具有神经保护作用，可通过IGF-1受体(IGF-1 receptor，IGF-1R)介导的信号途径发挥其对脑细胞的功能调控，但是IGF-1在脑内的作用仍有争议。因此阐明IGF-1抗PD神经元凋亡和炎症反应的分子机制具有重要的科学意义。
研究证实IGF-1与雌激素相互作用能够促进大脑发育、突触传递及神经元的存活和分化。IGF-1R和雌激素受体(estrogen receptor，ER)在神经元和神经胶质细胞共表达。IGF-1R主要表达在神经元和星形胶质细胞(astrocyte，AS)，是IGF-1神经保护作用的靶点。G蛋白耦联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor，GPER)是2005年Revankar等在science上首次报道的雌激素膜受体，主要介导雌激素的快速非基因组作用。激活的GPER能够对抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine, MPTP )诱导的DA能神经元的凋亡和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症反应，发挥神经元保护功能。最近，在乳腺癌和子宫内膜癌细胞的研究中发现，IGF-1可通过IGF-1R/PKC/MAPK信号通路调控癌细胞GPER的表达，促进癌细胞的增生。那么在中枢神经系统，我们提出IGF-1是否通过神经元和AS细胞膜表面IGF-1R介导的信号途径对抗神经毒素MPTP对黑质纹状体系统DA能神经元的损伤？GPER是否参与IGF-1的抗炎和抗凋亡作用?
本研究第一部分在整体动物水平，小鼠腹腔注射MPTP制备PD模型，探讨IGF-1是否能够通过IGF-1R介导的信号途径，发挥其抗炎和抗凋亡的神经保护作用，GPER是否参与其中。第二部分应用DA能神经细胞SH-SY5Y，1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium，MPP+)制备PD细胞模型，探讨IGF-1R和GPER是否参与IGF-1抗凋亡的神经保护作用。第三部分应用原代培养AS，MPP+诱导炎症反应，采用药理阻断和siRNA干扰技术探讨IGF-1R和GPER是否参与IGF-1的抗炎作用，并探讨IGF-1对AS的功能活动调控。
1.IGF-1对MPTP诱导的PD小鼠模型神经保护作用及分子机制研究
腹腔注射MPTP制备PD小鼠模型，侧脑室注射IGF-1、IGF-1R特异性阻断剂JB-1及GPER特异性阻断剂G15，应用行为学检测、免疫组织化学技术、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、实时荧光定量PCR(realtime PCR， RT-PCR)及免疫印迹技术(western blot)等，探讨IGF-1神经保护作用的分子机制。实验结果如下：
(1)免疫组化的结果显示，GPER在黑质区广泛表达。
(2)爬杆实验和转棒实验结果表明，IGF-1能够明显改善MPTP诱导的小鼠运动障碍(P<0.05，P<0.001)，此作用可被JB-1或G15所阻断(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。旷场实验结果显示，IGF-1明显增加小鼠的运动距离和平均速度(P<0.01，P<0.05)，此作用可被JB-1阻断(P<0.01)，G15有部分阻断作用，但无统计学意义。
(3)HPLC结果显示，IGF-1能够改善MPTP引起的纹状体DA及其代谢产物含量的降低(P<0.001，P<0.01)，此作用可被JB-1和G15阻断(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。(4)与MPTP组相比，IGF-1能够提高黑质区致密带TH-ir神经元的存活数目(P<0.05)。JB-1和G15能够抑制IGF-1的作用(P<0.01，P<0.05，P<0.001)。在TH蛋白水平，结果与此一致。
(5)IGF-1具有抗凋亡作用，能够逆转MPTP诱导的Bax和Bcl-2蛋白表达的变化(P<0.05)。IGF-1对Bax蛋白的调控作用只能被JB-1阻断(P<0.01)，而IGF-1对Bcl-2蛋白的调控作用可以被JB-1和G15所阻断(P<0.001)。
(6)为探讨MPTP是否通过活化的AS，促进PD的病理进程，本实验应用免疫荧光和westernblot技术，检测了AS的特异性标志物胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达。结果显示，IGF-1能够抑制MPTP诱导的GFAP表达的升高(P<0.05)，且IGF-1单用能够促进AS的增殖(P<0.01)。
(7)进一步的实验证实，IGF-1能够抑制MPTP诱导的TNF-α，IL-1β，COX-2和iNOSmRNA表达的升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，JB-1和G15能够阻断IGF-1的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。在蛋白水平，IGF-1显著抑制COX-2和iNOS蛋白表达的上调(P<0.001，P<0.05)，此作用可以被JB-1和G15所阻断(P<0.01，P<0.05)。
在整体动物水平，IGF-1可通过IGF-1R介导的信号途径抑制MPTP诱导的神经元的凋亡和AS的炎症反应，且GPER参与了IGF-1对黑质纹状体系统DA能神经元的保护作用。
2.IGF-1对抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的分子机制研究
采用MPP+处理SH-SY5Y细胞制备PD离体细胞模型，探讨IGF-1在离体细胞水平抗凋亡作用的分子机制。结果如下：
(1)不同浓度的IGF-1(12.5、25、50、100 ng/ml)能明显对抗MPP+的神经毒性，提高细胞活力(P<0.05，P<0.01)。
(2)不同浓度的IGF-1(25，50，100 ng/ml)能够抑制MPP+诱导的Bax蛋白表达的上调(P<0.001，P<0.05，P<0.01)及Bcl-2蛋白表达的下调(P<0.05，P<0.01)，JB-1和G15均能阻断IGF-1的抗凋亡作用(P<0.05，P<0.01)。
(3)IGF-1可明显抑制MPP+诱导的线粒体膜电位的降低(P<0.01)。JB-1可阻断IGF-1的此作用(P<0.05)。G15能部分阻断IGF-1的保护作用，但无统计学意义。
(4)单用IGF-1可以明显增加Akt和ERK的蛋白磷酸化水平，上调GPER蛋白表达，且具有时间依赖性(P<0.05，P<0.01)。
(5)JB-1、PI3-K拮抗剂LY294002或MEK拮抗剂PD98059可分别抑制IGF-1对Akt或ERK的磷酸化和GPER蛋白表达的上调(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。
在离体细胞水平，IGF-1R介导IGF-1抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的损伤，保护DA能神经元，GPER参与IGF-1的抗凋亡作用。IGF-1能够促进GPER蛋白的表达，此作用与PI3-K和MAPKs信号通路有关。
3.IGF-1对MPP+诱导的原代星形胶质细胞炎症反应的抑制作用机制研究
本实验采用MPP+建立原代AS炎症反应模型，应用RT-PCR、westernblot、免疫细胞荧光及siRNA干扰等实验技术，探讨IGF-1抗炎作用的分子机制及其对原代AS功能活动的影响。实验结果如下：
(1)GPER和IGF-1R与GFAP在AS共表达。
(2)不同浓度的IGF-1(12.5，25，50，100 ng/ml)可抑制MPP+诱导的COX-2和iNOS蛋白表达(P<0.01，P<0.05)。JB-1和G15能够阻断IGF-1对COX-2和iNOSmRNA和蛋白表达的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。
(3)MPP+能够明显促进P38、JNK和IκB的蛋白磷酸化(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。JB-1预处理能够阻断IGF-1对P38、JNK和IκB蛋白磷酸化的抑制作用(P<0.05，P<0.01)，G15可阻断IGF-1对JNK和IκB磷酸化的抑制作用(P<0.01)，但不能阻断IGF-1对p38的磷酸化抑制作用(P>0.05)。
(4)不同浓度的IGF-1(6.25，12.5，25，50和100ng/ml)单用能够明显增加谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1，GLT-1)和谷氨酸-天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter，GLAST)mRNA的表达(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，但100ng/mlIGF-1对GLT-1的基因表达没有影响。此作用可被阻断剂JB-1、G15、LY294002及PD98059所阻断(P<0.05，P<0.01)。
(5)IGF-1可明显促进Akt和ERK的磷酸化，且具有时间依赖性(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。JB-1、LY294002或PD98059可分别抑制IGF-1对Akt或ERK的蛋白磷酸化作用(P<0.05，P<0.001)。
(6)IGF-1能够时间依赖性上调c-fosmRNA及GPERmRNA和蛋白表达(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，此作用可被JB-1，LY294002或PD98059阻断(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。(7)siRNA干扰GPER的基因表达后，IGF-1对MPP+诱导的COX-2及iNOS基因和蛋白表达的抑制作用显著减弱(P<0.01，P<0.001)。
(8)siRNA干扰GPER的基因表达后，IGF-1对GLT-1和GLASTmRNA的诱导作用亦明显被抑制(P<0.01)。
GPER参与IGF-1对抗MPP+诱导的原代AS的炎症反应，通过抑制MPP+诱导的MAPKs、NF-κB信号通路激活，减少炎症因子的释放。进一步研究揭示GPER参与了IGF-1对原代AS功能活动的调节，IGF-1能够促进GPER蛋白和基因的表达，此作用与PI3-K/Akt和MAPKs/c-fos信号通路有关。
结论：IGF-1通过激活IGF-1R信号途径，抑制MPTP/MPP+诱导的神经元凋亡和AS的炎症反应，保护DA能神经元，雌激素膜受体GPER参与了IGF-1的神经保护作用。IGF-1能够调节中脑GPER基因和蛋白的表达，此作用可能与PI3-K/Akt和MAPKs/c-fos信号通路有关。