结核病是威胁人类健康的重大传染病,目前用于一线治疗的药物有吡嗪酰胺、异炯肼、链霉素、利福平和乙胺丁醇。随着药物化疗的推广,耐药性结核菌也随之大量出现,因此在临床上,对耐药性结核杆菌的检测显得尤为重要。结核杆菌对吡嗪酰胺产生耐药的主要原因是其pncA基因突变导致吡嗪酰胺酶的活性降低或者丧失。　　 结核杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测方法主要有表型检测和基因检测,但都存在着不可避免的缺陷。本研究发展了一种荧光定量PCR和体外蛋白质表达联合检测方法,直接从痰液样本中检测结核杆菌以及其吡嗪酰胺耐药性。本研究通过在pncA基因上游和下游的保守区域设计荧光定量PCR的引物,使扩增的目的片段包括后续体外表达PCR所需要的目的片段。利用Ct值通过标准曲线测定痰液中结核分枝杆菌后,再进行体外表达检测其耐药性。利用小麦芽胚体外无细胞表达系统表达出吡嗪酰胺酶,吡嗪酰胺酶可以催化吡嗪酰胺转化成吡嗪酸,后者与硫酸亚铁铵反应生成棕红色物质。通过反应液颜色的深浅判断吡嗪酰胺酶的活性高低,依次来检测痰液中结核分枝杆菌是否发生耐药性突变。以M.tuberculosis H37Ra为阳性对照,M.boris BCG为阴性对照,nuclease-free water为空白对照,测定三株临床痰液样本A12、B12、6121的耐药性,结果显示临床样本均有吡嗪酰胺酶活性,表明该方法是切实可行的。　　 本研究在本实验室建立的适合于临床分离株体外蛋白质表达检测的基础上,引入荧光定量PCR检测痰液巾结核分枝杆菌,检测本身灵敏度可达到10copies/μL甚至1 copy/μL,首次实现了痰液中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性的联合检测。联合耐药性检测不仅节约了检测的成本,也提高了检测的效率,并且该方法操作简单,适合在资源有限的医疗检测机构推广使用。