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目的：观察严重烧伤后心肌组织及缺氧培养条件下心肌细胞中HIF-1 α的表达变化规律及其作用，并分析其作用机制。 方法：实验模型1、乳鼠心肌细胞在1％O2、5％CO2和94％N2的混合气体中培养，制作缺氧模型。2、比较并筛选HIF-1 α干扰片段，构建最佳干扰双链干扰RNA（dsRNAi），转染筛选后的有效si-HIF-1 α-RNAi，进行缺氧培养。3、Wistar大鼠40％Ⅲ°烫伤模型检测指标1、用HPLC法测定培养心肌细胞ATP、ADP、AMP含量，并计算能荷及ATP／ADP比值。2、测定糖酵解关键酶（HK、PFK、LDH）的活性以及培养液中乳酸含量的变化。3、分别用Western-blotting和RT-PCR测定了心肌细胞及心肌组织中HIF-1 α蛋白及mRNA含量的变化。4、运用免疫组化技术，观察HIF-1α蛋白的表达与定位活化。 结果： 1、筛选出HIF-1 α最佳干扰片段序列。 正4′-CAA AAA CTG TAA AAA GAG CAC AGT TAC AGG ATT CGG TGT TTC GTC CTT TCC ACA AGA-3′ 反5′-CAA AAA CTG TAA AAA GAA TCC TGT AAC TGT GCT CGG TGT TTC GTC CTT TCC ACA AGA-3′ 2、缺氧可诱导心肌细胞中HIF-1 α的mRNA水平，蛋白水平增高。缺氧后半小时HIF-α迅速于细胞浆表达，1小时后细胞核内大量表达，出现核移位现象。转染有效RNA干扰片段后，缺氧处理后各时相点HIF-1 α mRNA水平较单纯缺氧组均有非常显著的降低，蛋白水平1小时内增高，其后迅速下降，其中缺氧1、3、6、12小时组均明显低于单纯缺氧组相应时相点。 3、缺氧心肌细胞内糖酵解酶HK、PFK和LDH活性显著升高，培养液中乳酸的含量也很快成倍增加。si-HIF-1α-RNAi组与单纯缺氧组相比HK、PFK和LDH活性增高不明显。培养液中乳酸的含量增长速度相对较慢。 4、心肌细胞缺氧时，ATP含量明显下降，其后（缺氧3-12h）维持在一较低水平，形成一缓慢变化时期，缺氧12-24h再次快速下降，达到最低，ADP、AMP含量缓慢第三军医大学硕十学位论文升高，变化趋势与ATP相反;si一HIF一1。一RNAi组与单纯缺氧组相比，ATP含量下降快速，无维持缓慢变化阶段，于6一12小时达到最低水平，ADP、AMP含量则快速升高。能荷，ATP/ADP比值的变化趋势与ATP相似。 5、40%Hl“烫伤后大鼠左、右心室组织HIF一1 0 mRNA、蛋白含量随伤后时间延长而逐渐增高，12小时达高峰。正常左、右心室内均有HIF一1 0 mRNA、蛋白表达。烫伤后左、右心室内HIF一1 QmRNA、蛋白表达不同，左心室量明显高于右心室。 结论: 1、本研究首次运用转染ddRNAi表达框法，在乳鼠心肌细胞中成功构建HIF一1。低表达模型，为全方位、深入的研究心肌细胞中HIF一1。的功能提供了良好的实验平台。与传统的基因敲除、RNA干扰技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，具有较好的操作性和广阔的应用前景。 2、HIF一la缺氧过程中的表达与缺氧的时间、程度密切相关。心肌细胞内HIF一1Q在缺氧CI.5小时达到高峰，免疫组化观察发现在缺氧0.5小时HIF一IQ主要位于细胞浆，缺氧1小时才‘大量出现核内表达，可能存在核移位受阻，原因可能为缺氧使微管受损，延缓了核移位。 3、本实验观察到:缺氧可使心肌细胞内HIF一1 0 mRNA水平，蛋白含量表达增加，糖酵解酶HK、PFK、LDH活性显著增高、培养液中LC浓度大幅度增加，ATP和能荷水平，在快速降至一较低水平后，维持一段时间，缺氧12小时后进一步下降;而ADP和AMP变化正好相反，逐渐增高。由于HK、PFK、LDH为HIF一IQ下游调控基因，我们推想:氧分压降低可诱导HIF一1。表达增强，从而促进HK、PFK、LDH表达、活性的上调，糖酵解供能增加，缓解了细胞能量供应匾乏状态。 4、采用转染ddRNAi表达框抑制心肌细胞HIF一1。的表达后发现:缺氧使糖酵解酶的活性增高减少，ATP和能荷水平持续快速下降，较正常心肌细胞提前进入不可逆损伤状态，表明HIF一1。低表达使细胞对缺氧的适应能力下降，进一步反证表明缺氧诱导因子具有明确的细胞保护作用，其机制为缺氧诱导HIF一l。的高表达增强了无氧糖酵解供能，为细胞延长了生存时间。 5、首先发现大面积重度烧伤可以诱导大鼠心肌组织HIF一1 0 mRNA水平增加，蛋白表达增加，其增加的幅度与J自肌缺血、缺氧程度密切相关。而且发现，正常左、右沪心室内均有HIF一1 0 mRNA、蛋白表达。烫伤后左、右J自室内HIF一1 a mRNA、蛋白表达不同，左心室量明显高于右心室。HIF一1。心肌组织中的表达，通过加强心肌供能，减轻心肌缺血、缺氧性损害的作用对烧伤后心肌细胞损伤具有一定保护作用，左心室第二军医大学硕士学位论文较右心室可能更加耐受缺氧。 鉴于上诉几点认识，我们认为HIF一1。对烧伤和缺氧心肌具有明显的细胞保护作用，上调其表达，可为临床心肌缺血的防治提供新的思路和方法。