【摘 要】
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氮素是植物必需的大量营养元素,广泛参与植物萌发、生长、开花和结实等诸多生理过程。为了维持作物较高的产量和品质,农民必须施加大量的氮肥。然而作物吸收利用氮素的效率并不高,只有30%-50%的氮素能被作物吸收。氮肥的大量施用不仅增加了作物生产的成本,而且造成严重的环境问题。因此,维持作物高产,同时减少氮肥使用量,已成为现代农业可持续发展必须要解决的问题。深刻理解植物吸收氮素的作用机制和解析植物氮素吸收
【基金项目】
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西北农林科技大学人才启动科研经费（Z111021604）； 国家自然科学基金（31770289）； 陕西省自然科学基金（2019JQ-135）； 中科院植物分子遗传国家重点实验室开放课题；
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氮素是植物必需的大量营养元素,广泛参与植物萌发、生长、开花和结实等诸多生理过程。为了维持作物较高的产量和品质,农民必须施加大量的氮肥。然而作物吸收利用氮素的效率并不高,只有30%-50%的氮素能被作物吸收。氮肥的大量施用不仅增加了作物生产的成本,而且造成严重的环境问题。因此,维持作物高产,同时减少氮肥使用量,已成为现代农业可持续发展必须要解决的问题。深刻理解植物吸收氮素的作用机制和解析植物氮素吸收的调控网络对于提高作物产量,改良作物的农艺性状,减少过量的氮肥施用和环境污染问题,促进农业的可持续发展具有重要意义。植物激素脱落酸（abscisic acid,ABA）在植物生长发育和生物非生物胁迫逆境应答等方面具有重要作用。ABA受体蛋白PYR/PYL/RCAR家族,磷酸酶PP2Cs以及蛋白激酶SnRK2s构成了植物ABA信号转导的核心通路,调控众多下游因子广泛参与植物生长发育和逆境适应。然而,ABA如何精细平衡植物生长发育和低氮逆境适应,是否有其他ABA信号中的调控因子参与其中尚不清楚,为基因编辑等技术应用于作物分子育种带来了障碍。本研究利用反向遗传学策略,以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料,通过对多种信号通路相关突变体在缺氮条件下的表型筛选,发现ABA合成缺陷突变体aba2-1和ABA受体多突变体pyr1pyl1pyl2pyl4在低氮胁迫下主根较野生型显著伸长,侧根密度显著增加,表现出低氮胁迫不敏感表型;进一步分析发现ABA信号通路PP2C（protein phosphatases of type 2C）磷酸酶四突变体abi1-2abi2-2hab1-1pp2ca-1在低氮胁迫下主根表现出相反的表型,主根生长较为敏感。ABA信号通路中关键激酶SnRK2s（sucrose non-fermenting1（snf1）-related protein kinase 2s）三突变体snrk2.2/2/3/2.6在低氮胁迫下表现出明显的不敏感表型,主根伸长显著增加。随后通过非损伤微测技术发现snrk2.2/2/3/2.6突变体在低氮胁迫下对硝态氮的吸收相较于野生型显著增强,同时幼苗根部和地上部积累的硝态氮含量显著增多。随后通过酵母双杂交实验（Y2H）、荧光双分子互补实验（Bi FC）、萤火素酶互补实验（LCA）以及免疫共沉淀实验（Co-IP）等手段,进一步发现SnRK2.2/2.3/2.6与硝态氮转运感受蛋白NRT1.1（nitrate transporter 1.1）存在物理互作。磷酸化实验结果显示SnRK2s能磷酸化NRT1.1且主要磷酸化N末端Ser8位点和C末端Ser585位点。爪蟾卵母细胞电压钳实验结果显示模拟磷酸化状态的NRT1.1S585D其高低亲和硝态氮转运能力均被抑制,而模拟磷酸化状态的NRT1.1S8D不影响其硝态氮转运能力。通过对模拟磷酸化和非磷酸化转基因回复株系NRT1.1S585D/chl1-5、NRT1.1S585A/chl1-5、NRT1.1S8D/chl1-5和NRT1.1S8A/chl1-5的低氮表型分析发现,NRT1.1S585D/chl1-5表现出与NRT1.1缺失突变体chl1-5类似的根生长和硝态氮吸收表型,而其他回复株系表型与野生型无差异。这些电压钳和表型实验结果表明SnRK2s磷酸化NRT1.1能够抑制其硝态氮转运活性和根生长表型,并且NRT1.1Ser585位点是SnRK2s磷酸化的关键功能性位点。利用烟草瞬时转化以及模拟磷酸化和非磷酸化拟南芥转基因株系,发现SnRK2s磷酸化NRT1.1不影响其蛋白定位和稳定性,然而会降低幼苗对外源ABA的敏感性。最后,通过分析不同物种NRT1.1的蛋白同源性和保守性分析发现Ser585位点不保守,但作为丝氨酸或苏氨酸的功能具有一定的保守性。综上所述,本研究的结果表明ABA信号中的关键蛋白激酶SnRK2s在拟南芥低氮胁迫下的根生长和硝态氮吸收过程中起重要作用。植物在遭受氮饥饿胁迫时,通过ABA信号中的SnRK2s磷酸化NRT1.1调控其硝态氮转运活性介导植物对低氮胁迫的耐受性。此外鉴定到NRT1.1Ser585在植物体内是一个新的功能性磷酸化位点,模拟磷酸化状态的NRT1.1S585D其高低亲和硝态氮转运能力均被抑制。本研究揭示了植物在低氮胁迫下通过ABA信号平衡逆境适应与生长的新机制,拓展了植物响应低氮胁迫的调控网络,为兼具抗逆性和氮高效利用的作物改良奠定了理论基础。
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