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谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是催化谷胱甘肽(GSH)的亲核S原子与底物分子的亲电子基团发生亲核加成反应的多基因同工酶家族。根据其所含氨基酸序列不同被分为六种亚型,分别是α,μ,ω,π,θ and ζ,其中GSTpi(π)是哺乳动物细胞中最重要的亚型。GSTpi对于细胞抵抗氧化应激反应及保护细胞免受各种毒素物质引起的细胞凋亡有重要意义。本实验室首次发现了内源性GSTpi的抗炎作用,并采用重组技术在体外高效表达了 GSTpi蛋白。本实验室的实验进一步显示,注射重组GSTpi蛋白可明显降低小鼠脓毒症和内毒素休克模型的死亡率,并减少多种促炎因子的释放,从而发挥抗炎作用,为重组GSTpi蛋白的药用研发奠定了基础。我们过去的工作也显示了体外重组GSTpi蛋白的入胞现象,但其入胞的机制尚不清楚,而对其入胞机制的研究是我们了解重组GSTpi蛋白发挥药效学作用的重要内容。细胞的内吞方式很多,广义上被分为吞噬作用(phagocytosis)和胞饮作用,后者又包括巨胞饮(macropinocytosis)、网格蛋白依赖型内吞(clathrin-dependent endocytosis)、小窝蛋白依赖型内吞(caveolin-dependent endocytosis)及非网格蛋白和小窝蛋白依赖型内吞(clathrin-and caveolin-independent endocytosis),不同的非网格蛋白和小窝蛋白依赖型内吞又需要不同的蛋白分子,如flotillin-1蛋白等。在本课题中,我们在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化了GSTpi蛋白,然后用FITC荧光染料对该蛋白进行标记,通过各种工具药的使用,经流式细胞术、激光共聚焦显微术等检测和观察明确了重组GSTpi蛋白的入胞机制,此外本实验中还采用冰冻切片技术检测重组GSTpi蛋白在动物体内的主要组织分布。在本实验室过去实验的基础上,我们明确了重组GSTpi蛋白可以进入RAW264.7、THP-1和小鼠腹腔巨噬细胞,且进入细胞的GSTpi具有转移酶活性。细胞松弛素D(CD)和拉春库林B(LB)是目前公认的改变肌动蛋白聚合或肌动蛋白微丝组织性的试剂,二者可结合于肌动蛋白的生长端,抑制聚合反应,诱导肌动蛋白解聚,从而破坏吞噬作用,抑制细胞外物质通过吞噬作用进入细胞。CD和LB对于FITC-GSTpi蛋白内吞入RAW264.7细胞没有影响,且两种药物都不会影响RAW264.7细胞的存活,说明FITC-GSTpi蛋白入胞不依赖于吞噬作用。我们进而分析GSTpi蛋白是否通过胞饮作用进入细胞,FITC标记的右旋糖酐(FITC-dextran)常作为荧光标记物显示巨胞饮体形成过程中内吞细胞外物质,阿米洛利(EIPA)通过抑制Na+/H+的交换从而抑制巨胞饮作用。FITC-dextran对照实验显示大量FITC-dextran进入RAW264.7细胞,说明RAW264.7细胞中巨胞饮途径是活跃的,但EIPA处理并不影响FITC-GSTpi蛋白的内吞入胞,表明FITC-GSTpi蛋白入胞不依赖于巨胞饮途径。网格蛋白依赖型内吞是胞饮的另一种形式。氯丙嗪(CPZ)是一种阳离子两亲性药物,被认为可以通过可逆性的网格蛋白转位和调节蛋白从质膜到胞内囊泡而抑制网格蛋白小窝的形成,从而抑制网格蛋白依赖型内吞入胞途径。我们用CPZ处理细胞后发现FITC-GSTpi蛋白入胞量明显减少,说明FITC-GSTpi蛋白入胞与网格蛋白依赖型内吞途径有关。文献报道,RAW264.7细胞膜表面不表达小窝蛋白,而FITC-GSTpi蛋白可以内吞入RAW264.7细胞,说明FITC-GSTpi蛋白入胞不通过小窝蛋白依赖型途径。非网格蛋白和小窝蛋白依赖的内吞途径也是部分细胞外物质内吞入胞的方式,其具体的机制及过程目前不是很清楚,但其主要依赖于flotillin-1蛋白,而flotillin-1又被认为是脂筏的标记蛋白。本实验采用flotillin-1 siRNA(m)干扰flotillin-1蛋白的表达,研究其对于FITC-GSTpi蛋白入胞的影响。干扰flotillin-1蛋白的表达不影响FITC-GSTpi的内吞,说明其入胞方式与此途径无关。细胞中的一些结构及物质与多种内吞途径相关,如微管可影响细胞形态,辅助胞内运输,诺考达唑(Noc)和紫杉醇(TX)处理细胞均减少FITC-GSTpi蛋白入胞量,说明FITC-GSTpi蛋白入胞与微管有关。多种内吞途径对胆固醇的波动非常敏感,胆固醇的清除影响网格蛋白依赖型、小窝蛋白依赖型内吞途径。甲基-β-环糊精(MβCD)是一种葡糖苷的循环寡聚物,它可以通过从质膜中提取出胆固醇来抑制与胆固醇相关的内吞作用,如小窝蛋白依赖型内吞和网格蛋白依赖型内吞。MβCD对FITC-GSTpi蛋白入胞具有显著的抑制效应,且加入水溶性胆固醇可逆转MβCD对FITC-GSTpi蛋白入胞的抑制作用,说明FITC-GSTpi蛋白入胞与胆固醇有关。但RAW264.7细胞膜表面不表达小窝蛋白,说明FITC-GSTpi蛋白与网格蛋白依赖型内吞有关。综上所述,FITC-GSTpi蛋白的入胞主要通过网格蛋白依赖型内吞,其中,胆固醇、微管等物质与结构参与FITC-GSTpi蛋白的内吞。FITC-GSTpi蛋白的入胞与巨胞饮途径、小窝蛋白依赖型内吞和flotillin-1依赖型内吞无关。