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疫苗接种是目前控制动物传染病最有效的手段。疫苗接种是目前控制动物传染病最有效的手段,寻求更高效的免疫佐剂是当前研究的热点。据报道,应用免疫佐剂或抗原呈递系统配合疫苗使用能显著提高疫苗免疫效果。本研究使用经美国FDA和欧洲药物管理局（EMA）批准上市的生物可降解材料乳酸-羟乙酸共聚物（poly—lacticacid—CO-glycolicaeid,PLGA）作为抗原载体,运用双乳液溶剂蒸发法制备PLGA微球（MPs）包裹模式抗原OVA,利用壳聚糖的天然吸附性将还原氨化法制备的甘露糖化壳聚糖吸附在PLGA微球表面,以达到对巨噬细胞和树突细胞的主动及被动靶向。运用激光粒度仪、BCA试剂盒评估微球的理化特性及载药量,通过体外和体内实验研究其免疫增强活性,为开发靶向巨噬细胞和树突状细胞的甘露糖化壳聚糖PLGA微球抗原呈递系统提供研究基础。主要研究进展及研究成果如下:一、甘露糖化壳聚糖PLGA微球的合成与鉴定:本研究使用还原氨化法制备了甘露糖改性的壳聚糖,元素分析结果显示合成成功,产物性质稳定。对PLGA使用量,OVA使用量及外水相PVA浓度进行L9（3~3）正交实验优化,采用BCA法检测微球载药量,使用激光粒度仪检测微球粒径。结果显示PLGA微球合成的最佳条件为PLGA 40mg,OVA 50mg,PVA浓度2%,8000r/min剪切,乳化时间60s,油水比1:10。按最优处方制备的微球粒径约为6.45μm,载药量约为7.9%且重现性良好。同时制备了FITC标记的MPs,激光粒度仪及BCA检测结果显示FITC标记的MPs的理化特性与MPs的理化特性基本相似。二、甘露糖化壳聚糖PLGA微球在体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响:本研究将小鼠巨噬细胞RAW264.7在体外用FITC-MPs及FITC-OVA干预8h,通过CCK-8法测定巨噬细胞活性,结果显示浓度在10μg.m L-1-60μg.m L-1时含有等量FITC-OVA的各组MPs干预的巨噬细胞的细胞活性均在90%以上。FITC-CS-PLGA MPs与FITC-MAN-CS-PLGA MPs组细胞活性大于100%,与OVA组相比差异极显著,P<0.01。说明壳聚糖及甘露糖化壳聚糖PLGA微球制剂能显著提高巨噬细胞的增殖活性。将FITC-MAN-CS-PLGA MPs与小鼠巨噬细胞RAW264.7培养12h制成爬片,DAPI染色细胞核,使用激光共聚焦显微镜观察。结果显示巨噬细胞能将FITC-MAN-CS-PLGA MPs内化至细胞质中。将20μL FITC-MPs(含40μg·m L-1 FITC-OVA)与小鼠巨噬细胞RAW264.7共孵育12h。使用SDS细胞裂解液裂解巨噬细胞,在荧光酶标仪下检测荧光强度,FITC-MAN-CS-PLGA MPs组与FITC-OVA组、FITC-CS-PLGA MPs组相比,差异极显著（P<0.01）。说明甘露糖化壳聚糖PLGA微球制剂能显著提高巨噬细胞对FITC-OVA的吞噬效率.三、甘露糖化壳聚糖PLGA微球对小鼠免疫反应的影响:将小鼠随机分为5组,每组22只,将MPs分散在生理盐水中,使用生理盐水、OVA、PLGA MPs、CS-PLGA MPs、MAN-CS-PLGA MPs皮下注射,每间隔一周免疫一次。首免28天后,处死小鼠,无菌收集脾细胞用抗CD4-PE,抗CD8-PE,抗CD3e-FITC染料染色,使用流式细胞仪进行FACS分选,检测CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的百分比,结果显示MAN-CS-PLGA MPs组CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞的比值显著增高,与其他组相比较差异极显著,P<0.01,提示MAN-CS-PLGA MPs会引起小鼠Th偏向的脾淋巴细胞分化。首免24h后,无菌收集小鼠脾细胞使用CD11c-FITC、CD80-PE、CD86-PE、MHC II-PE染料染色,用流式细胞仪检测小鼠脾脏组织中CD11C+DCs细胞表面CD80、CD86、及MHC II分子的表达。结果显示相比于其他组MAN-CS-PLGA MPs组小鼠脾脏CD11c+DCs表面分子CD80,CD86,MHC II的表达显著提高,P<0.05,表明使用甘露糖化壳聚糖修饰PLGA包封抗原能有效地提高初始抗原暴露。随机选择小鼠并在首次免疫后第14、21、28、35和42天摘眼球法采集小鼠血液,使用间接ELISA法检测微球制剂对血清中抗体水平及细胞因子水平的影响。结果表明,首免42天后MAN-CS-PLGA MPs组小鼠血清OVA特异性Ig G及Ig G亚类（Ig G1,Ig G2a,Ig G2b）抗体水平显著提高,与OVA组相比差异极显著,P<0.01。Ig G1、Ig G2a抗体水平提示Th1型免疫应答的情况。细胞因子检测结果显示,与单用可溶性OVA组相比,小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-2、IFN-γ的含量显著提高,P<0.05。由此可见,MAN-CS-PLGA MPs免疫小鼠能显著提高受免小鼠Th1/Th2型免疫反应,从而增强了小鼠的细胞和体液免疫反应,其免疫增强作用的机制可能是通过甘露糖受体的靶向作用促进树突细胞成熟,提高树突状细胞对抗原的提呈效率来激活T细胞引发免疫反应。综上所述,甘露糖化壳聚糖PLGA微球的最佳工艺处方为PLGA 40mg,OVA50mg,PVA浓度2%,剪切速度8000r/min,乳化时长为60s,油水为1:10。甘露糖化壳聚糖PLGA微球在体外能靶向巨噬细胞表面的甘露糖受体,提高巨噬细胞内化抗原的效率。在小鼠体内能刺激小鼠体液免疫及细胞免疫,增加Th1及Th2型细胞因子的产生并能诱导机体产生平衡的Th1/Th2免疫反应。其免疫增强作用的机制可能是通过靶向甘露糖受体提高树突状细胞和巨噬细胞对微球的吞噬从而提高抗原的提呈效率及促进树突细胞成熟来激活初始T细胞引发免疫反应。