【摘 要】
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目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是秋冬季节引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体,也是儿童与青少年哮喘的重要诱因。研究发现,肠道菌群可通过“肠-肺轴”调节肠外粘膜免疫,影响呼吸道疾病如流感病毒感染或者哮喘的发生发展。然而,肠道菌群改变对RSV感染的影响作用及其作用机制目前尚不清楚。本研究利用抗生素诱导肠道菌群失调后再感染RSV的实验动物模型,通过体
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目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是秋冬季节引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体,也是儿童与青少年哮喘的重要诱因。研究发现,肠道菌群可通过“肠-肺轴”调节肠外粘膜免疫,影响呼吸道疾病如流感病毒感染或者哮喘的发生发展。然而,肠道菌群改变对RSV感染的影响作用及其作用机制目前尚不清楚。本研究利用抗生素诱导肠道菌群失调后再感染RSV的实验动物模型,通过体内外实验,探讨肠道菌群失调对RSV感染及RSV介导的呼吸道炎症应答的影响作用,阐明其作用机制,为加深理解“肠-肺轴”,以及理解肠道菌群与呼吸道疾病,尤其是与呼吸道病毒感染的相互作用提供实验基础。研究方法:建立肠道菌群失调小鼠感染RSV的实验模型。通过HE染色观察肺组织炎症反应,利用Real-time PCR技术检测肺组织中细胞因子表达水平,流式细胞术分析肺组织中免疫细胞的类型及数量,从而证明肠道菌群失调能够影响RSV感染诱导的肺局部免疫应答;免疫磁珠分选巨噬细胞,Real-time PCR检测其Arg1、i NOS、IL-10、IL-1βm RNA的表达水平,观察巨噬细胞活化情况;采用16S r DNA测序技术检测抗生素引起的肠道菌群的改变;灌胃补充丁酸梭菌,观察丁酸梭菌是否能够恢复因肠道菌群失调改变了的RSV感染免疫应答;通过体外丁酸与RSV感染的RAW264.7鼠源巨噬细胞共培养,证明丁酸通过影响信号通路蛋白表达水平抑制RAW264.7分泌炎性因子。结果:1、口服链霉素导致肠道菌群失调:16S r DNA测序发现链霉素能显著降低小鼠肠道内厚壁菌门的丰度,并增加拟杆菌门的丰度。厚壁菌门内主要以乳酸菌及梭菌减少为主,拟杆菌门内及拟杆菌增加为主。2、肠道菌群失调加重RSV感染诱发的气道炎症:链霉素诱导肠道菌群失调后再感染RSV,导致小鼠肺组织内炎性细胞浸润程度增强,肺泡灌洗液中炎性细胞总数明显增多,其中巨噬细胞及中性粒细胞增多最为明显,证实肠道菌群失调加重RSV感染肺部炎症。3、肠道菌群失调影响RSV感染鼠肺组织局部免疫应答:链霉素诱导肠道菌群失调后再感染RSV,Real-time PCR检测发现肺组织内IFN-γ及IL-17表达显著增加,IL-5表达显著下降。流式细胞术检测发现肺组织巨噬细胞数量明显增加,其细胞因子i NOS及IL-1β表达显著增多,而Arg1及IL-10表达显著下降,提示肠道菌群失调使RSV感染诱导的免疫应答向Th1、Th17及M1型极化偏移。4、补充丁酸梭菌可改善感染RSV的肠道菌群失调鼠的免疫紊乱:链霉素诱导肠道菌群失调后补充丁酸梭菌,再感染RSV,发现小鼠肺组织炎症细胞浸润减轻,肺泡灌洗液中炎性细胞总数明显减少,其中巨噬细胞、淋巴细胞数量减少最为明显;Real-time PCR检测发现肺组织内IFN-γ及IL-17表达显著降低,IL-5表达显著增加;流式细胞术检测发现肺组织巨噬细胞数量明显减少,其细胞因子i NOS及IL-1β表达显著降低,Arg1表达水平显著增加,提示补充丁酸梭菌能减轻因肠道菌群失调加重的RSV肺部炎症,并且能使模型鼠肺组织免疫应答向Th2及M2极化偏移。5、丁酸盐促进感染RSV的RAW264.7细胞分泌M2型细胞因子:RAW264.7细胞体外丁酸盐预处理后再感染RSV,其细胞因子i NOS及IL-1β表达水平明显下降,而Arg1及IL-10表达水平显著增加。同时,NF-κB、P38及ERK1等信号分子表达显著降低,提示丁酸可能通过抑制巨噬细胞内NF-κB、P38及ERK1信号通路促进巨噬细胞由M1型向M2型极化。结论:肠道菌群失调可通过改变肺局部免疫应答加重RSV气道炎症;补充丁酸梭菌可恢复肠道菌群失调诱发的此种免疫失调并减轻RSV气道炎症。
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