[目 的]1.对昆明医科大学第一附属医院和第二附属医院临床微生物室2017年1月至2021年2月间分离鉴定保存的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（carbapenems-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA）的分子流行病学进行调查,了解CRPA菌株的分子流行病学和遗传背景,为临床预防和治疗铜绿假单胞菌感染提供理论依据和参考。2.测试CRPA菌株对13种抗菌药物的体外敏感性,了解其耐药特征,为临床铜绿假单胞菌感染的治疗提供理论依据和参考。3.通过多种分子生物学和生物信息学技术分析碳青霉烯酶基因携带情况、外膜蛋白oprD基因的突变情况、药物外排泵的表达情况和生物膜产生情况等,进而探讨铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药机制,为临床预防和治疗此类菌株感染提供理论依据,并对此类菌株的院内感染和控制提供理论依据。[方法]第一部分CRPA分离株的耐药情况和MLST分型研究调查1.CRPA分离株的体外药物敏感性情况调查收集昆明医科大学第一附属医院和第二附属医院临床微生物室2017年1月至2021年2月间检出并保存的分离株,经全自动微生物质谱鉴定系统Bruker biotyper进行菌株鉴定。使用K-B纸片扩散法检测所有菌株对氨曲南（ATM）的敏感性;用Vitek2Compact全自动微生物鉴定药敏仪检测以下12种抗菌药物的敏感性:哌拉西林（PIP）、头孢他啶（CAZ）、头孢吡肟（FEP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）、庆大霉素（GM）、妥布霉素（TM）、阿米卡星（AN）、环丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、多粘菌素B（PB）。共纳入来自尿液、血液、分泌物、无菌体液和肺泡灌洗液中分离得到的81株CRPA菌株,取患者感染部位分离的第一株CRPA为受试菌株,均为非重复菌株。2.CRPA菌株MLST分型调查采用铜绿假单胞菌MLST分型方案,应用聚合酶链式反应（PCR）扩增CRPA菌株的7个管家基因,测序确认等位基因号并获得其序列型（sequencetype,ST）,并通过BioNumerics软件对各ST型别绘制最小生成树进行克隆关系和遗传信息的分析。第二部分铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的耐药机制研究1.碳青霉烯酶基因的基因型检测使用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增铜绿假单胞菌中常见的7种碳青霉烯酶基因,包括blaKPC、blaGES、blaIMP、blavIM、blaSPM、blaNDM和blaOxA-40;扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,并对阳性扩增子进行Sanger法测序,测序结果进行序列比对分析。2.外膜孔蛋白oprD基因的突变检测与分析对铜绿假单胞菌oprD基因全长进行PCR扩增并Sanger法测序;将其基因序列与标准菌株铜绿假单胞菌PAO1的oprD序列进行比对,分析耐药突变,比对软件为MEGA-X。3.外排泵MexAB-OprM基因mexA表达水平的检测应用Real-Time qPCR技术检测外排泵MexAB-OprM基因mexA以及内参基因rpoD的表达水平,以铜绿假单胞菌ATCC27853的mexA和rpoD基因的表达情况作为对照;用PCR方法扩增MexAB-OprM过表达菌株的外排泵调节基因mexR、nalC和nalD并测序,结果与标准菌株铜绿假单胞菌PAO1中对应基因的序列进行比对分析。4.生物膜形成检测应用微量滴定板形成试验检测铜绿假单胞菌的生物膜形成情况,应用PCR法检测生物膜形成相关基因pslA,探讨生物膜形成与pslA基因的相关性。[结 果]第一部分CRPA分离株的耐药情况和MLST分型研究调查1)81株CRPA菌株主要来自尿液、分泌物、血液和引流液,分别占43.20%、18.52%、16.05%和11.11%,其它的依次为肺泡灌洗液、胆汁、脑脊液和腹水,分别占4.94%、2.47%、2.47%和1.23%;科室来源分布以烧伤科和急诊科为主。2)81株CRPA菌株对除多粘菌素B外的其它抗菌药物的耐药率均较高;未发现对多粘菌素B耐药的菌株。34株ST3390菌株对除多粘菌素B以外的所有抗菌药物的耐药率均高于94%。3)MLST分型显示81株分离株属于36种不同的ST型别,其中31种为数据库中已知的ST型别,另外5种为本研究新发现的ST型别。ST3390为最主要ST型别,占41.9%（34/81）。不同年份铜绿假单胞菌的序列型别组成和优势序列型别不一样,应加强对铜绿假单胞菌感染的监测。第二部分铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的耐药机制研究1)所检测的7种碳青霉烯酶基因中,仅检出IMP、VIM和NDM型碳青霉烯酶基因,检出率分别为37.04%、27.16%和1.23%,未检测到KPC、GES、SPM和OXA-40型碳青霉烯酶基因,未发现共表达多种碳青霉烯酶基因的菌株。2)oprD基因序列比对分析发现,81株CRPA菌株中,有78（96.29%）株CRPA菌株发生了各种类型的突变,其中68株存在不同类型的oprD基因突变且以单个或多个碱基的插入或缺失为主（62株,占76.54%）,其中以oprD基因第109位置上A碱基的缺失为主;其它的突变类型包括碱基突变导致终止密码子提前出现,氨基酸点突变;5株PCR结果检测为阴性;3株未检测到任何形式的突变。3)mexA基因过表达菌株有17株,占20.99%。对这17株过表达菌株的调节基因mexR、nalC和nalD进行扩增测序,序列与标准菌株铜绿假单胞菌PAO1比对,显示5株CRPA菌株发生mexR基因或者MexR蛋白的点突变,其中3株发生MexR蛋白V126E的氨基酸点突变,1株发生MexR蛋白V115E、L119K、V126E和L135H的氨基酸突变,1株mexR基因发生小片段碱基缺失（nt135-146缺失1 1个碱基TATCGACGAAC）;有1 7株菌株发生NalC蛋白的氨基酸点突变,所有菌株均发生G71E的氨基酸点突变,其中1株同时还发生A145V、Q182K和L206V的氨基酸突变,8株同时发生Q182K、L206和VS209R的氨基酸突变,7株同时发生S209R的氨基酸点突变,1株同时发生L206V和S209R的氨基酸突变;10株菌株发生NalD蛋白的氨基酸点突变,其中1株发生N130S的氨基酸点突变,9株发生W49S的氨基酸点突变。所有突变类型中,以NalC蛋白的G71E和S209R氨基酸突变最常见。本研究发现了 MexR的新的突变类型V115E,L119K和L135H;NalC的新的突变类型Q182K,L206V;NalD的新的突变类型W49S和N130S。4)微量滴定板试验结果显示有91.35%（74/81）的菌株形成生物膜,而PCR法检测生物膜形成相关基因pslA阳性率仅有75.3%（61/81）;产碳青霉烯酶菌株中有86.79%检出生物膜形成相关基因pslA,不产碳青霉烯酶菌株中有53.57%检出生物膜形成相关基因pslA。[结论]1)81株CRPA菌株对除多粘菌素B以外的抗菌药物耐药率较高（>50%）;MLST分型共检出36种类别的ST型,其中以ST3390为主（占41.97%）,且检出 ST3645、ST3646、ST3647、ST3648 和 ST3649 这 5 种新的序列型别。2)铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制复杂多样且不同地区的差异较大,OprD蛋白发生各种形式的突变且伴随生物膜的形成是本研究中81株PA对碳青霉烯类药物耐药的主要机制;其中碳青霉烯酶基因的检出率为65.43%,远高于国内其它研究,这可能与选取的菌株的标本类型不同有关;过表达外排泵MexAB-OprM不是其耐药的主要机制,本研究发现的其调节基因蛋白MexR、NalC和NalD的新突变类型可能是导致其过表达的原因,需要进一步研究。3)所有ST3390菌株对除多粘菌素B以外的其他抗菌药物的耐药率均高于94%,其oprD基因在nt109位置上均缺失碱基A,且该突变在之前的文献中极少报道,该突变是否是造成其高水平耐药的原因需要进一步确认。