【摘 要】
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背景:降钙素基因相关肽(CGRP)是1983年应用DNA基因重组技术和分子生物学技术发现的第一个舒血管活性多肽,由37个氨基酸组成,它是降钙素基因在神经组织经翻译后表达的产物.CGR
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背景:降钙素基因相关肽(CGRP)是1983年应用DNA基因重组技术和分子生物学技术发现的第一个舒血管活性多肽,由37个氨基酸组成,它是降钙素基因在神经组织经翻译后表达的产物.CGRP广泛分布于中枢和外周神经系统、心脑血管系统、消化道和内分泌等系统.CGRP具有很强的舒血管活性,对心、脑血管有强大的扩张作用.CGRP与许多临床疾病有密切关系,是目前研究的热点之一.
近年来,随着分子生物学的迅速发展,基因导入技术得到不断改进并在基因治疗中显示了良好的应用前景.腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体,作为非整合病毒,具有感染宿主范围广,外源基因表达水平高,在受染细胞内不发生整合,没有致癌和致突变的危险等优点,在基因导入研究中倍受关注.
方法:本实验以25g普通成年雄性小白鼠为取材对象,从小鼠脊髓背根神经元中获取总RNA,在引物两端导入限制性内切酶识别序列,通过RT-PCR扩增得到CGRP的全序列.通过双酶切和连接反应将CGRP基因导入PUC57载体上,通过转化,筛选,将鉴定为阳性的重组PUC57-CGRP质粒与pShuttle-CMV质粒进行双酶切和载体连接反应,最后得到重组pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭质粒.
结果:
1.成功通过RT-PCR扩增得到CGRP目标序列,全长433bp.
2.成功构建重组PU3C57-CGRP质粒.
3.成功构建pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭质粒.
结论:腺病毒载体理化性质稳定.容易制备、纯化,病毒滴度高,转导效率较高,无致突变的优点.本实验中采用的腺病毒载体AdEasy系统是近年来较新的载体系统,同源重组效率较高,方法简便、快速、实验周期短.本实验构建的重组pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭质粒,为进一步制备CGRP的腺病毒载体,研究其在动物体内的基因治疗作用提供了非常理想的载体.
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