氯化琥珀胆碱中毒大鼠给药点皮肤处药物含量的UHPLC-HRMS法测定及靶器官损伤的形态学变化

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氯化琥珀胆碱(suxamethonium chloride)又称司可林、氯琥珀胆碱、氯化琥珀酰胆碱,化学名为二氯化2,2-[(1,4-二氧-1,4-亚丁基)双(氧)]双[N,N,N-三甲基乙胺]二水合物,分子式为C14H30Cl2N2O4·2H2O。其属于去极化类肌肉松弛药,临床用作全身麻醉时的肌肉松弛剂,可引起心动过缓、心律失常、心搏骤停等不良反应,若超量注射该药或不配合使用呼吸机的话,可致人支气管痉挛或过敏性休克死亡,属于B级有机剧毒品,近年来氯化琥珀胆碱被不法分子应用于飞镖射杀家禽、家畜类动物,更有甚者,氯化琥珀胆碱被犯罪分子用作杀人工具的案例屡见报道,根据文献记载,安徽、浙江、广东等地是此类案件的高发区。氯化琥珀胆碱的法医学检验从而成为当今司法实践中的一个新问题。由于氯化琥珀胆碱在体内快速分解成琥珀酸和胆碱,约2%以原形,其余以代谢物的形式从尿液中排出,而这两种分解物在体内本身就是存在的,这给氯化琥珀胆碱的体内检测又增加了难度。因此寻求氯化琥珀胆碱中毒后的法医病理学及理化特征,为氯化琥珀胆碱中毒案件定性提供科学的参考执行标准和依据。目的:1.观察皮下注射氯化琥珀胆碱(SUC)致大鼠相关器官或组织的病理变化。2.UHPLC-HRMS法测定注射点皮肤中SUC的含量并建立其方法学,UPLC-MS/MS法大鼠肾脏组织中2H-SUC的方法学验证。方法:1.大鼠皮下注射SUC,光镜下观察肌肉、心、肾、肺及气管等组织的病理学变化;电镜下观察肌肉、肾、注射点皮肤等组织的病理学变化。2.用超高压液相色谱串联高分辨率质谱仪(UHPLC-HRMS)法测定大鼠注射点处皮肤SUC含量,色谱采用Luna NH2色谱柱(2 mm×100 mm,,3μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈等度洗脱,流速是0.2 ml/min,进样体积是10μl,柱温37℃,进样时间为5 min。质谱测定采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法、可加热的电喷雾离子源(HESI)及正离子扫描模式。3.用UPLC-MS/MS法测定肾脏中2H-SUC的方法学验证;色谱采用Luna NH2色谱柱(2 mm×100 mm,3μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈等度洗脱,流速为0.2 ml/min;正离子扫描模式,多反应监测模式下,电喷雾离子化源进行检测;考察该方法的线性关系与检测限、准确度和精密度、回收率、基质效应和稳定性。结果:1.SUC 1.5、3.0和6.0 mg/kg可致大鼠肌肉、心、肾及肺等组织发生了明显的病理学组织学损伤;Mallory磷钨酸组织化学染色法显示SUC可引起大鼠心肌纤维维疏松、间隙增大,免疫组织化学法检测了中毒大鼠肌肉、心、肾、肺及支气管等组织中CD3、CD20、CD31、CD56和神经分泌颗粒膜蛋白等蛋白表达情况,仅发现SUC可增加大鼠肾间质中CD3的表达,电子显微镜观察到SUC可引起肾细胞中线粒体及骨骼肌细胞中肌节和肌丝的损伤。2.紫外全波长扫描在SUC标准品溶液、加SUC大鼠血清及皮下注射SUC大鼠血清中均未观察到特定的吸收峰;通过UHPLC-HRMS法,在大鼠注射点处皮肤中检测到了SUC,其含量随剂量增加而加大。SUC在0.2-10 ng/ml线性范围良好,回收率为80.55%~90.44%,相对标准偏差均小于15%,精密度和准确度均符合要求。3.通过UPLC-MS/MS法,肾组织中2H-SUC在0.5~100 ng/m L线性范围良好,日内、日间精密度和准确度均小于15%,回收率在85.30%~96.76%之间,经过处理后的样品不存在明显的基质效应。结论:1.SUC皮下注射可致大鼠心、肾、肺及肌肉组织发生明显的病理组织学损伤。2.UHPLC-HRMS法可测定其注射点处皮肤中的SUC,并建立大鼠皮肤中氯化琥珀胆碱的方法学。3.UPLC-MS/MS法可测定肾组织中2H-SUC,并建立肾组织中氘代氯化琥珀胆碱的方法学。
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