大肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康,具有高复发和远处转移的生物学特性,全球每年新增病例近1000000例,492000例死亡。随着经济的进步,生活方式和饮食结构的变化,我国大肠癌每年发病率也快速递增,特别是大城市上升趋势更为显著。大肠癌男女发病率等同,在40岁以后发病危险度随着年龄增加而递增；资料显示我国大肠癌男性发病率约为16.2/100000,女性约为14.5/100000,大肠癌已经成为我国致死性肿瘤中最常见的死亡原因之一。然而,大肠癌的治疗效果并不理想,在所有的病人中约有半数患者治疗失败。大肠癌传统治疗方法,即外科手术治疗、放射治疗和化学药物治疗方法的不断发展和完善,在延长患者生存期和提高患者生存质量方面取得了长足的进步；但是手术和放疗是局部治疗,难以控制肿瘤的复发和转移,化疗药物往往缺乏组织选择性和特异性,对骨髓等正常人体重要器官和组织产生严重的毒副作用,在过去几十年,大肠癌的五年生存率一直徘徊在40-50%左右。因此,迫切需要寻找新的治疗手段,其中基因治疗是近年来研究的热点方向之一。肿瘤侵袭转移是一个非常复杂的多步骤过程,需要突破细胞外基质和基底膜组成的多个结构屏障,然后在远隔部位建立新的增殖旺盛的细胞集落,其中的每个事件都相当复杂,整个过程受到许多条信号转导通路相互交联、组成的信号转导网络的精确调控。此外,肿瘤细胞的侵袭转移,一方面需要胞外蛋白酶降解周围组织外,另方面需要肿瘤细胞本身的迁移能力。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是一类特异的催化磷脂酰肌醇酯物质的激酶。正常情况下,由其活化而产生的类脂产物3,4-二磷酸磷脂酞肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酞肌醇[PI(3,4,5)P3]作为第二信使结合并激活多种细胞内的靶蛋白,形成一个信号级联复合物,最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。哺乳动物的PI3K家族主要有三型,在PI3K家族中,IA型PI3K和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt(或PKB)所组成的信号通路因其与肿瘤发生发展的相关性,近年来备受瞩目。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、粘附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。IA型PI3K是由p85调节亚基和p110催化亚基组成的异二聚体,p85调节亚基对于p110催化亚基的稳定、聚集以及IA型PI3K的激活是必须的,p85α是PI3K家族中表达量最多的调节亚基,由PIK3R1基因编码,自从有研究表明p85α突变可以引起PI3K/Akt通路的激活,从而证明PI3K p85α是一种癌基因以来,便引起许多研究者的兴趣。目前对PI3Kp85α的研究,主要集中在肿瘤中PI3K p85α所发生的突变及突变形式,但是对于其在肿瘤的侵袭转移中的作用,则较少报道。RNA干扰是通过实验手段向细胞内导入一段双链RNA (dsRNA),宿主细胞对这段dsRNA迅即产生反应,其胞质中的核酸内切酶Dicer,将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA-siRNA,这些siRNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效特异地阻断体内特定基因的表达,使细胞出现特定基因缺失的表型,从而达到某些实验或治疗目的。本课题组已成功应用RNA干扰技术构建了抑制PI3K p85α表达的大肠癌Lovo、SW480稳定表达细胞株Lovo(shRNA/324)(L324)、SW480(shRNA/1124)(SW1124)。本研究在系统地检测PI3K p85α在大肠粘膜正常组织-大肠腺瘤-原发性大肠癌组织-大肠癌转移癌组织中的表达差异和分布特点,同时在RNA干扰抑制PI3K p85α表达的基础上,观察下调PI3K p85α表达对大肠癌细胞侵袭转移能力的影响并初步探讨其可能的机制。材料与方法一、PI3K p85α在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义用免疫组织化学法检测PI3K p85α在大肠粘膜正常组织、大肠腺瘤、原发性大肠癌以及大肠癌转移组织中的表达情况,并分析PI3K p85a表达与大肠癌临床病理特征的关系。二、PI3K p85a表达缺失对大肠癌细胞侵袭转移的影响。1、Transwell侵袭实验观察改变PI3K p85α表达对大肠癌细胞侵袭能力的影响。2、Transwell迁移实验和肿瘤细胞划痕愈合实验观察改变PI3K p85a表达对大肠癌细胞迁移运动能力的影响。3、明胶酶谱实验观察改变PI3K p85α表达对大肠癌细胞基质金属蛋白酶-2分泌及活性的影响。4、平板克隆形成实验观察改变PI3K p85α表达对大肠癌细胞独立性生长的影响。三、统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件统计。免疫组化结果采用秩和检验(Kruskal-Wallis test),其中PI3K p85a表达水平与大肠组织类型及大肠癌Dukes分期之间的相关性采用等级相关系数(Spearman相关系数)检验。其它数据两组间比较采用t检验,以均数±标准差(mean±SD)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、PI3K p85a在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义免疫组化结果显示PI3K p85α表达主要定位于大肠病变组织上皮细胞的细胞浆,胞核中不表达,在间质炎症细胞中也有少量表达。PI3K p85a蛋白在正常大肠粘膜呈低表达或阴性,在腺瘤组织中PI3K p85a蛋白表达相对于正常大肠粘膜开始升高,在大肠癌组织中显著升高,而在转移癌中表达最高。PI3K p85a蛋白在大肠癌癌变及侵袭转移过程中阳性表达的增加有显著性意义(P=0.000)。大肠癌中高中低分化各组的PI3K p85a蛋白表达阳性趋势的差异无显著性意义(P=0.058),但是在不同Dukes分期的大肠癌中PI3K p85α蛋白表达阳性趋势的增加有显著性意义(P=0.015),其中Dukes B和Dukes C期的表达水平高于DukesA期,而伴有远处转移的Dukes D期大肠癌PI3Kp85a蛋白表达水平最高。二、RNA干扰靶向抑制PI3K p85a表达对大肠癌细胞Lovo、SW480侵袭转移的影响1、Transwell侵袭实验显示细胞接种24小时后,在聚碳酯膜可见肿瘤细胞穿过微孔后的变形形态,Lovo和L324细胞的穿膜细胞数分别为405.80±7.11,108.33±6.06,P=0.000,sw480和sw1124细胞的穿膜细胞数分别为147.93±6.51,74.67±6.50,P=0.000,RNA干扰靶向抑制PI3K p85a表达后Lovo和sw480细胞的侵袭能力均显著下降,差异有统计学意义。2、Transwell迁移实验显示细胞接种24小时候后Lovo,L324,sw480和sw1124细胞的穿膜细胞数分别为562.93±5.15,114.87±5.45,306.40±11.82,155.47±9.20。RNA干扰靶向抑制PI3K p85a表达后Lovo和sw480细胞的迁移能力均显著下降,经两独立样本t检验,差异均有统计学意义。3、通过对Lovo, L324, sw480和sw1124四组细胞24 h体外划痕实验的观察,L324细胞组与Lovo细胞相比,12h时迁移能力出现降低,24 h时Lovo细胞组划痕接近愈合,与L324细胞组相比迁移能力具有显著差异。24h时sw480与sw1124相比细胞划痕面积明显缩小。4、明胶酶谱分析显示RNA干扰靶向抑制PI3K p85a表达后Lovo和sw480细胞分泌活性MMP-2显著减少。5、平板克隆形成实验可以观察细胞独立性生长的能力,从而反映细胞的恶性程度,RNA干扰靶向抑制PI3K p85a表达后Lovo和sw480细胞克隆形成能力减弱。结论1、PI3K p85a蛋白在大肠正常粘膜、大肠腺瘤、大肠癌、大肠癌淋巴结转移组织中的表达呈上升趋势,说明PI3K p85a在大肠癌的发生发展和侵袭转移中起重要作用。2、RNA干扰靶向抑制PI3K p85α蛋白表达可以抑制大肠癌Lovo细胞和SW480细胞侵袭能力。3、RNA干扰靶向抑制PI3K p85α蛋白表达可以抑制大肠癌Lovo细胞和SW480细胞的迁移能力。4、RNA干扰靶向抑制PI3K p85a表达可以减少大肠癌Lovo细胞和sw480细胞分泌活性MMP-2,提示PI3K p85a调控大肠癌的转移可能与其影响MMP-2的活性有关。5、RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达可以降低大肠癌Lovo细胞和SW480细胞克隆形成能力。