第一部分HMGB1在可卡因诱导大鼠奖赏行为中的作用目的:有研究报道可卡因暴露后可激活中枢免疫系统,然而神经元-免疫轴在可卡因诱导的奖赏记忆中的作用仍未知。同时有文献报道Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/小胶质细胞信号调节可卡因相关行为,然而其机制仍不清楚。核蛋白高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)被释到胞外空间后,可作为TLR4等的上游信号,其是否也可以调节可卡因相关的行为?本研究拟通过建立大鼠被动给药模型和可卡因诱导的条件位置偏好行为,探讨HMGB1在伏隔核区变化,确定HMGB1信号在可卡因诱导的奖赏记忆中的作用。方法:采用腹腔被动给药和条件位置偏好评分检测可卡因诱导的大鼠奖赏行为;糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT),高架十字迷宫和旷场实验(open field test,OFT)评价干预手段或药物的行为学特异性;蛋白免疫印迹检测和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)用于检测HMGB1表达变化;组织免疫荧光标记SD大鼠伏隔核区(Nucleus Accumbens,NAc)神经元HMGB1的变化;大鼠NAc区脑区定位注射,探讨调控HMGB1表达对可卡因诱导的奖赏记忆的影响。结果:(1)通过微透析和ELISA检测伏隔核区细胞外HMGB1的变化,与生理盐水组相比,反复可卡因暴露显著增加细胞外HMGB1含量(D7,Control:6.07±4.01 ng/ml;Cocaine:18.96±1.96 ng/ml,P<0.01)。(2)通过蛋白免疫印迹检测分析伏隔核区突触蛋白的组成,反复可卡因暴露引起HMGB1蛋白在突触部位的富集。(3)可卡因暴露诱导大鼠产生条件位置偏好,与生理盐水组相比,评分显著增加(Control:36.01±33.91s;Cocaine:271.9±30.19 s,P<0.0001),且大鼠伏隔核区HMGB1蛋白水平显著增加(Control:1.00±0.03;Cocaine:1.21±0.06,P<0.05)。(4)通过组织免疫荧光实验分析发现,可卡因暴露诱导大鼠伏隔核区神经元HMGB1由核内转移至胞外。(5)与对照组比,伏隔核区神经元特异性过表达HMGB1后,大鼠条件位置偏好评分显著增加(Control:-4.88±38.86 s;HMGB1-OE:227.00±69 s,P<0.05)。(6)腹腔注射HMGB1抑制剂甘草素和生胃酮后发现,50 mg/kg甘草素使大鼠的条件位置偏好评分由258.9±22.11 s显著降低至-127.5±95.58 s(P<0.05);20 mg/kg生胃酮使大鼠的条件位置偏好评分由258.9±22.11 s显著降低至-9.81±29.42 s(P<0.01)。但均不影响大鼠的自发活动、焦虑水平和自然奖赏。此外,情景训练前给药也不影响情景恐惧记忆的获得。(7)与对照组比,下调伏隔核区HMGB1表达显著降低大鼠条件位置偏好评分(Control:298±61.9 s;sh HMGB1:-53.59±39.48 s,P<0.001)。(8)NAc区注射小肽模拟或者拮抗HMGB1的功能,结果发现与磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)对照组比(387.3±50.12 s),在条件位置偏好训练后给予Box A处理,大鼠条件位置偏好评分显著降低(-52.30±42.74 s),S106-Box B处理组的条件位置偏好评分也显著降低(8.240±42.95 s),而C106-Box B处理组的条件位置偏好评分没有明显改变(281.7±110.6 s);但在训练前给予不同剂量可卡因,S106-Box B处理组的条件位置偏好评分都显著降低。(9)腹腔注射30 mg/kg米诺环素抑制小胶质细胞的激活,大鼠的条件位置偏好评分由300.1±28.38 s显著降低至58.42±59 s(P<0.05)。结论:可卡因暴露诱导大鼠产生条件位置偏好,同时伏隔核区胞外和突触部位的HMGB1水平增加,且神经元核内的HMGB1释放至胞外。过表达HMGB1可增加可卡因诱导的条件位置偏爱好;抑制HMGB1表达特异性降低可卡因诱导的大鼠条件位置偏好,且不影响其自发活动。提示HMGB1在可卡因诱导的大鼠奖赏行为中起重要作用。第二部分HMGB1介导可卡因诱导的大鼠奖赏行为的机制目的:HMGB1的主要受体是TLR4和晚期糖基化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products,RAGE),两者都可以在小胶质细胞上表达,已有文献报道可卡因成瘾与小胶质细胞激活有关,但伏隔核区HMGB1对小胶质细胞的激活调节是否在可卡因诱导的奖赏行为中发挥关键作用尚不清楚,本研究旨在探讨HMGB1-小胶质细胞或其他HMGB1相关信号在可卡因诱导的奖赏行为中的作用及可能机制。方法:采用被动给药和条件位置偏好评分检测大鼠奖赏相关行为;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,Q-PCR)、蛋白免疫印迹检测分析大鼠NAc和前额皮层(medial prefrontal cortex,m PFC)蛋白表达变化;采用免疫共沉淀(coimmunoprecipitation,Co-IP)进一步分析HMGB1功能的改变;通过电生理实验观察HMGB1对可卡因诱导的突触适应性改变;通过调整条件位置偏好训练模式,再给予HMGB1抑制剂处理,进一步明确HMGB1在可卡因诱导的奖赏行为中的作用及机制。结果:(1)连续腹腔注射可卡因三天后,大鼠伏隔核区HMGB1蛋白水平增加至1.21±0.05(P<0.01),但在同一时间点,伏隔核区内HMGB1 m RNA水平并没有增加。m PFC区HMGB1的蛋白水平在整个可卡因暴露过程中无明显改变。(2)连续腹腔注射可卡因三天后,大鼠伏隔核区的Iba1蛋白水平开始增加,并持续到第七天;而ED1的蛋白水平在连续给药7天后才增加。(3)50 mg/kg甘草素降低可卡因诱导的条件位置偏好,同时抑制可卡因暴露所致的伏隔核区小胶质细胞的活性增加;而30 mg/kg米诺环素降低可卡因诱导的条件位置偏好,但可卡因暴露导致的伏隔核区HMGB1的蛋白增加并没有被逆转。(4)单次可卡因注射后伏隔核区TLR4蛋白水平增加,并持续到重复给药七次后;而TLR2的蛋白水平在重复给药七次后才增加。(5)可卡因条件位置偏好训练后,大鼠伏隔核区的RAGE蛋白水平升高至1.23±0.02(P<0.0001)。(6)下调HMGB1拮抗可卡因暴露导致的TLR4和RAGE增加,以及下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号的改变。(7)沉默HMGB1基因表达减少可卡因条件位置偏好训练后NAc区AMPA受体亚基Glu A2总蛋白水平,不影响Glu A1、Glu A3,以及NMDA受体亚基Glu N2A、Glu N2B蛋白表达。(8)HMGB1可以与Glu A2和Glu N2B结合,且与Glu A2的结合位点为Glu A2843-852。(9)可卡因暴露后,大鼠伏隔核中央区的钙通透的AMPA受体(Ca2+-permeable AMPARs,CP-AMPARs)比率增加到22.46±2.02%(P<0.05);20 mg/kg生胃酮降低伏隔核中央区CP-AMPARs的比率至11.42±3.94%(P<0.05);而50 mg/kg甘草素增加CP-AMPARs的比率至48.98±7.51%(P<0.01)。(10)在多场景的条件位置偏好模型中,完成所有训练后,可卡因组在场景B中条件位置偏好评分无明显变化,而给予50 mg/kg甘草素或20 mg/kg生胃酮明显改变大鼠在场景B中条件位置偏好评分。(11)改变多场景条件位置偏好训练模式,先在场景A中获得条件位置偏好,在陌生的场景B中再训练,然后返回场景A中进行priming检测。与生理盐水组相比,生胃酮取消了训练本身的作用。结论:HMGB1通过与Glu A2结合和激活小胶质细胞来调节可卡因诱导的CP-AMPARs的适应性改变。可卡因暴露后,伏隔核区小胶质细胞的激活依赖于胞外的HMGB1,当可卡因相关记忆再次被激活时,依赖于HMGB1的小胶质细胞激活损伤新信息的学习,从而维持原有的记忆。以上结果表明HMGB1介导可卡因相关的不良行为,其机制可能与改变突触和小胶质细胞的适应性有关。