论文部分内容阅读
目的:探究体外实验条件下不同浓度的恩度(rh-Endo,Recombinant human endostatin)联合放疗(RT,Radiotherapy)对食管鳞癌细胞的生长增殖、克隆成瘤及血管拟态生成(VM,Vaculogenic mimicry)方面的作用,并阐明恩度联合放疗对食管鳞癌细胞的增生、成瘤、血管拟态生成的相关分子机制。方法:(1)采用CCK-8法检测不同浓度恩度(0、25、50、100、200、400、600和800 μg/ml)单独给药处理24h后,对人类食管鳞癌细胞株ECA109和TE13的细胞生长增殖抑制作用,并绘制出细胞抑制率直方图;并选取低于IC20的高低两种恩度浓度,应用于后续实验。(2)克隆集落形成实验,经各种浓度的恩度作用后,使用6-MV X线450cGy/min剂量率的实验条件下,经过不同的放射线剂量0,2,4,6,or8Gy处理,食管癌细胞株克隆形成的数目,观察不同浓度的恩度作用下食管癌细胞株ECA109和TE13经过IR处理之后肿瘤细胞存活成瘤的情况,并拟合出存活曲线;(3)利用3D培养及管腔形成实验观察高低浓度的恩度对不同剂量的辐射处理引起食管癌细胞的血管生成拟态现象的影响;并以成管长度及分支节点数为标准,绘制直方图。(4)通过免疫印迹实验Western blot检测不同药物浓度不同辐照剂量对食管鳞癌细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表达的影响,观察不同处理条件下Snail/E-cadherin信号通路的变化。结果:(1)不同浓度的恩度对ECA109和TE13细胞的量效性影响不明显,提示恩度不能有效影响肿瘤细胞的生长增殖能力；(2)克隆形成实验发现,单纯辐照能明显抑制两种食管癌细胞的集落形成,但单纯用药或辐照联合用药抑制细胞集落形成的效果差异没有明显的统计学意义,说明恩度不能直接影响肿瘤细胞的存活,不能抑制肿瘤细胞成瘤。考虑后续实验的可行性、临床常规放疗剂量的实用性并参考大量文献资料,后续实验选取6 Gy为放疗剂量,恩度选取＜IC20的低、高两种药物浓度(100和400μg/ml)进行比较,联合治疗中采用先药后放作用时序。(3)3D培养及管腔形成实验结果示恩度联合放射能明显减少血管生成拟态现象,相较于单纯辐照组。综述所述,相对于单纯用药组,恩度联合辐照组的肿瘤细胞的管腔形成能力明显受抑制。进一步说明体外实验中恩度能减弱肿瘤细胞向远处转移的能力。(4)免疫印迹分析(Western Blotting)检测单纯给药组、单纯辐照组及高、低浓度恩度联合辐照后ECA109和TE13细胞中Wnt/β-catenin以及Snail/E-cadherin信号通路相关蛋白的变化。单独辐照组中:辐照处理组与空白组相比,与肿瘤细胞增殖、成瘤相关通路Wnt/β-catenin中的关键蛋白β-环连蛋白(β-catenin)下调,上皮细胞标志性的E-钙粘蛋白(E-cadherin)的下调、E-钙粘蛋白转录抑制因子Snail蛋白、间质细胞标志性的N-钙粘蛋白(N-cadherin)上调;不同浓度的恩度联合辐照组:相同辐照剂量组内β-catenin的表达水平未随恩度浓度变化发生明显改变。不同辐照剂量组间β-catenin的变化同上。而联合恩度的辐照组E-cadherin表达水平上调,同时Snail蛋白、N-cadherin下调,且呈现明显的量效性关系。综上所述,放疗抑制了肿瘤细胞的Wnt/β-catenin信号通路,激活了 Snail/E-cadherin信号通路,等导致食管癌细胞增殖成瘤能力减弱,诱导了血管生成拟态现象的发生。然而使用恩度后虽然不能进一步抑制Wnt/β-catenin信号通路,但是逆转了 Snail/E-cadherin信号通路的蛋白趋势,即恩度明显抑制了 ECA109和TE13细胞上皮间质化的过程,进而抑制了食管癌细胞血管拟态生成的能力。结论:食管癌的放射治疗虽然抑制了肿瘤细胞的增殖,阻止了肿瘤的成瘤,却增加了肿瘤细胞的血管拟态生成能力。恩度,重组人血管内皮抑制素是一种抑制血管生成的生物制品。恩度不能直接抑制食管癌细胞增殖、成瘤,但可以通过抑制上皮间质化EMT过程,改变Snail/E-cadherin通路蛋白的表达,有效抑制了食管癌细胞的血管生成拟态现象,进而减少了放疗后食管癌细胞远处转移的能力。