研究背景和目的:牙周炎是一种由细菌引起的慢性感染性炎症反应,它的病因复杂,牙周炎症破坏和牙槽骨吸收的机制仍不十分明确。目前的主流观点认为牙菌斑微生物是牙周炎的启动因子,产生的致病菌及其内毒素如脂多糖（LPS）等代谢产物激发了宿主炎症反应和免疫反应,产生大量白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子,从而促进破骨分化与骨吸收。牙周炎时的牙槽骨吸收程度还与宿主全身和局部等多种因素有关,比如维生素D的缺乏,钙、磷的缺乏或不平衡等易感因素。目前,牙周膜干细胞（PDLSCs）因具有多向分化和免疫调节等特性成为牙周炎治疗的研究热点。然而,在炎症环境下,PDLSCs的多向分化潜能及其调节牙周组织再生的能力都受到不同程度的抑制,具体分子机制目前仍不明确。牙周膜相关蛋白-1（PLAP-1）,又称为asporin（ASPN）,是富含亮氨酸的重复蛋白多糖家族中的一员。PLAP-1高表达在骨关节炎患者关节软骨中,抑制软骨形成,是骨关节炎、腰椎间盘退变和类风湿关节炎的发病机制之一。现有研究表明在牙周组织中PLAP-1特异性高表达在牙周膜中,过表达PLAP-1可抑制牙周膜细胞的分化和矿化作用,因此,PLAP-1是牙周膜成骨分化中的一个负性调节因子。而在大鼠实验性牙周炎模型中,PLAP-1高表达在牙槽骨表面的单核细胞、多核细胞等炎症细胞中,同时使用免疫荧光细胞化学共定位检测显示,PLAP-1与CD68+浸润细胞呈正相关,以上结果均证实PLAP-1参与了牙周炎的发生发展过程。维生素D是目前临床上治疗骨质疏松的常用药物,它在体内通过二次羟化生成它的活化形式1,25-二羟维生素D3（1,25（OH）2D3）而进一步发挥生理作用。1,25（OH）2D3主要是通过与靶细胞胞质中的维生素D受体（VDR）结合后转录调控下游基因表达,进一步发挥其生理效应。1,25（OH）2D3在体内的靶器官分布广泛,VDR也广泛分布于参与钙磷代谢的小肠、骨和肾,同时也存在于牙体、脑、皮肤等。大量的研究结果显示,维生素D缺乏会增加牙周炎的发病率,促进骨吸收;增加血清维生素D水平则可以降低牙周炎的发病率,同时促进受损的牙周组织修复。而1,25（OH）2D3在牙周炎中的正向调节作用可能是通过抗炎、促骨形成等途径实现的,因此,1,25（OH）2D3在牙周炎中的确切作用与作用机制仍需要我们进一步研究。综上所述,1,25（OH）2D3的抗炎及促骨形成作用对牙周炎的治疗具有积极意义,又考虑到PLAP-1在牙周膜成骨分化中的的负性调节作用以及在牙周炎炎症细胞中的高表达,鉴于牙周组织也是1,25（OH）2D3的靶器官,且1,25（OH）2D3作为一种多功能的脂溶性维生素其下游靶基因分布广泛,因此我们提出科学假设:1,25（OH）2D3可能通过抑制PDLSCs中PLAP-1的表达解除部分牙周炎症状态时对牙周组织成骨活性的抑制,促进牙槽骨再生。若能阐明在炎症状态下1,25（OH）2D3对PDLSCs PLAP-1表达的影响及其调控机制,可能为牙周病治疗新靶点的筛选和相关促进骨再生药物的研发奠定理论基础。材料和方法:1.1,25（OH）2D3对LPS诱导的炎症状态下人的牙周膜干细胞（hPDLSCs）中PLAP-1表达的影响（1）应用酶解组织块法体外分离、培养hPDLSCs,特异性表面标志物利用流式细胞术进行检测,多向分化潜能利用成骨、成脂、成软骨诱导进行检测。（2）不同浓度的LPS处理体外培养的hPDLSCs,应用CCK-8实验检测LPS对hPDLSCs增殖能力的影响;实时定量PCR（qRT-PCR）法对炎症因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）进行检测;蛋白质印迹（Western-blot）和qRT-PCR检测PLAP-1成骨分化相关因子RUNT相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COL1）以及PLAP-1的表达情况。（3）不同浓度的1,25（OH）2D3处理体外培养的hPDLSCs,通过CCK-8实验检测对hPDLSCs增殖能力的影响;对hPDLSCs进行成骨诱导,检测hPDLSCs ALP活性,分析细胞的ALP染色程度,分析细胞的茜素红染色强度,检测成骨分化相关因子RUNX2、ALP和COL1以及PLAP-1的mRNA和蛋白表达水平;免疫荧光和Western-blot检测1,25（OH）2D3对VDR表达情况的影响。（4）在以上的实验中筛选出合适浓度的1,25（OH）2D3和LPS,对hPDLSCs进行分组,通过茜素红染色、Western-blot和qRT-PCR检测成骨分化相关因子RUNX2、ALP、COL1以及PLAP-1的蛋白和mRNA表达的情况检测细胞成骨分化能力的变化;应用qRT-PCR法检测炎症因子IL-6、IL-8的表达情况。2.1,25（OH）2D3降低LPS诱导的炎症状态下hPDLSCs PLAP-1表达水平的机制研究应用软件分析PLAP-1基因转录调控区内可能的VDR结合位点,根据分析结果的基因序列,利用引物软件辅助设计相应的扩增引物。应用染色质免疫沉淀技术（ChIP）检测VDR与PLAP-1转录调控区DNA的结合,分别使用计算机软件预测的VDR结合位点设计的引物进行PCR扩增,验证结合情况。根据ChIP结果中得到的PLAP-1转录调控区内可能的VDRE结合位点的基因序列,通过双荧光素酶报告基因实验分析此片段的转录情况。3.1,25（OH）2D3对大鼠牙周炎模型牙周组织破坏以及牙周膜中PLAP-1表达的影响体内通过丝线联合正畸结扎丝于龈沟内结扎上颌第一磨牙构建大鼠牙周炎模型,4w后建模成功,建模成功后其中一组按照120ng/kg/d灌胃法给予1,25（OH）2D32周,获取大鼠上颌骨作为组织形态学评价对象。通过石蜡切片进行苏木精-伊红（HE）染色对比观察牙周组织形态学变化;抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法检测牙周组织中破骨细胞的数目;利用免疫组织化学染色方法检测PLAP-1的表达情况;采用micro-CT重建大鼠上颌磨牙区,对牙槽骨的吸收破坏区域进行进行骨生物学参数分析评价。单纯结扎组作为对照。实验结果:1.1,25（OH）2D3对炎症条件下hPDLSCs成骨分化相关因子以及PLAP-1的影响（1）成功分离、培养及鉴定hPDLSCs成功分离培养hPDLSCs,该细胞能够表达间充质干细胞的特异性表面标记物,在不同诱导培养基的诱导下可以向成骨、成脂、成软骨方向分化,满足间充质干细胞的标准。（2）LPS能够抑制hPDLSCs成骨相关因子的表达并诱导PLAP-1的表达用不同浓度的LPS处理hPDLSCs,CCk-8结果表明,LPS浓度为1、10μg/mL时,对细胞增殖无明显影响,浓度为20、50μg/mL时能够抑制细胞增殖活性;qRT-PCR实验结果发现,随着LPS浓度的增加,炎症因子IL-6、IL-8以剂量依赖的形式增强;Western-blot和qRT-PCR结果表明,低水平的（LPS 1μg/mL）能够促进hPDLSCs成骨分化相关因子RUNX2、ALP和COL1的表达;较高水平的LPS（10、20或50μg/mL）能够显著抑制hPDLSCs的成骨分化,且随着LPS浓度的升高,PLAP-1表达增加。这些结果表明,在较高浓度LPS诱导的炎性条件下,hPDLSCs向成骨分化能力明显被抑制,同时PLAP-1的表达上调,提示PLAP-1可能参与了炎症相关的成骨抑制过程。因此,我们选择10μg/mL这个浓度用于后续的实验。（3）1,25（OH）2D3促进hPDLSCs的成骨分化并且抑制PLAP-1的表达用不同浓度的1,25（OH）2D3处理hPDLSCs,CCK-8实验表明,较高浓度的1,25（OH）2D3（lnM或10nM）对hPDLSCs的增殖活性具有一定的抑制作用;免疫荧光结果表明在未添加1,25（OH）2D3时,VDR的特异性免疫荧光信号较弱,添加1,25（OH）2D3后,VDR的特异性免疫荧光信号增强;Western-blot结果显示,加入1,25（OH）2D3后,VDR表达上调;ALP活性检测发现在1,25（OH）2D3浓度为10nM时,ALP的活性最高,1,25（OH）2D3浓度为100nM时,ALP的活性明显受到抑制;通过qRT-PCR和Western-blot检测hPDLSCs中成骨分化相关因子的表达,结果发现1,25（OH）2D3能够促进RUNX2、ALP和COL1的表达,且具有较强的剂量依赖性;此外,我们还发现较高浓度的1,25（OH）2D3（lnM或10nM）能够明显抑制成骨诱导培养过程中PLAP-1的表达;添加1,25（OH）2D3组与比对照组相比,ALP染色更深;茜素红染色比对照组产生的矿化结节更多,颜色更红。上述结果表明,1,25（OH）2D3在促进成骨分化方面具有积极的作用,并在这个过程中抑制了 PLAP-1的表达。我们选择10nM这个浓度进行相关后续的研究。（4）1,25（OH）2D3通过下调PLAP-1表达逆转LPS对hPDLSCs成骨分化的抑制作用qRT-PCR和Western-blot结果显示,1,25（OH）2D3可以部分解除LPS对成骨分化相关因子RUNX2、ALP、COL1表达的抑制作用和炎症相关因子IL-6、IL-8的表达促进;1,25（OH）2D3下调了 LPS对PLAP-1的诱导作用;此外,茜素红染色法证实了 LPS+1,25（OH）2D3处理组较LPS组钙化结节形成增多、增大、染色更深。我们的研究结果发现1,25（OH）2D3部分逆转了 LPS对hPDLSCs成骨分化能力的抑制作用及对炎症因子的诱导表达,提示1,25（OH）2D3可能在牙周炎的治疗过程中起到了积极的作用。此外,1,25（OH）2D3逆转了 LPS对PLAP-1的上调作用,我们推测1,25（OH）2D3逆转LPS诱导的成骨能力抑制作用部分是通过下调PLAP-1表达实现的。2.1,25（OH）2D3降低LPS诱导的炎症状态下hPDLSCs PLAP-1表达水平的机制研究根据VDRE碱基序列的特点,软件分析包含PLAP-1基因及其侧翼序列在内的共计30357bp的一段基因序列,共获得两个可能存在的VDR结合位点（Region 1、Region 2）。用VDR抗体对超声后的复合物进行免疫共沉淀,分别使用计算机软件预测的VDR结合位点设计的引物进行PCR扩增,然后进行凝胶电泳。结果发现在对PLAP-1 Region2结合位点设计的引物进行PCR扩增时,1,25（OH）2D3联合VDR抗体处理组检测到目的条带的出现,而在未加入1,25（OH）2D3联合VDR抗体组以及对照的IgG抗体组均未有明显的目的条带的出现,ChIP实验结果表明在1,25（OH）2D3的作用下,VDR与PLAP-1启动子区Region2出现结合,而在Region 1则没有出现结合,显示VDR能结合PLAP-1转录调控区Region2片段。扩增位于PLAP-1启动子区Region2的维生素D反应元件（VDRE）,构建pGL4-PLAP-1荧光素酶报告基因质粒。荧光素酶报告实验结果显示1,25（OH）2D3的处理使pGL4-PLAP-1荧光素酶启动子转录活性降低了 35%,而pGL4-luciferase荧光素酶启动子活性未受影响。这些结果表明,1,25（OH）2D3通过PLAP-1启动子区Region 2的VDRE发挥抑制作用。3.1,25（OH）2D3对大鼠牙周炎模型牙周组织破坏以及牙周膜中PLAP-1表达的影响成功构建了大鼠实验性牙周炎模型;Micro-CT显示实验性牙周炎+饲喂1,25（OH）2D3组的大鼠牙周组织中骨吸收破坏的量较牙周炎组明显减少,Tb.Th、Tb.N、BMD和Tb.Sp较牙周炎组均有所改善;HE结果显示实验性牙周炎组牙龈组织可见明显的炎性细胞浸润,牙龈乳头形态破坏,牙槽骨吸收较多,实验性牙周炎+饲喂1,25（OH）2D3组以上情况明显改善,说明1,25（OH）2D3能够抑制牙周炎症,减轻牙槽骨的吸收破坏;TRAP染色结果表明实验性牙周炎+饲喂1,25（OH）2D3组TRAP阳性细胞数较试验性牙周炎组减少;免疫组织化学结果显示,实验性牙周炎组的骨吸收破坏区呈PLAP-1高表达,实验性牙周炎+饲喂1,25（OH）2D3组可见PLAP-1阳性表达降低,提示1,25（OH）2D3下调牙周炎症骨吸收破坏区PLAP-1的表达。结论:1,25（OH）2D3通过与PLAP-1启动子区VDRE结合,转录抑制hPDLSCs中PLAP-1表达,部分解除牙周炎症状态时对牙周组织成骨活性的抑制,减少牙槽骨吸收破坏。