背景血管钙化（vascularcalcification,VC）在多种慢性或代谢性疾病中发生,包括衰老、终末期肾病、糖尿病和心血管疾病等。VC可以发生在血管壁的不同位置,包括血管内膜和血管中膜。其中,动脉粥样硬化斑块的钙化可增加斑块的不稳定性,导致斑块破裂、诱发急性冠脉综合征和缺血性脑卒中等疾病的发生。研究发现VC是一种细胞主动调节的过程,多种类型的细胞参与其中,包括血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）、周皮细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞、血管间充质干细胞和内皮细胞。在不同病理性刺激条件下,VSMCs可由收缩型向分泌型或钙化型转化,伴随着收缩型蛋白标记物的下降,如平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha,SM22）、钙调蛋白和平滑肌肌动蛋白 alpha（smooth muscle actin alpha,α-SMA）等,和钙化型标记物的增加,如runt 相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2,Runx2）,骨桥蛋白（osteopotin,OPN）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）和骨形态发生蛋白 2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）等,VSMCs的这种表型转化在VC中发挥着至关重要的作用。另外,越来越多的研究发现巨噬细胞在VC中也发挥着重要的作用。同VSMCs类似,巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块中也可以发生钙化表型转化。目前,由于VC发生机制的多样性和复杂性,动脉粥样硬化斑块钙化尚无有效的预防和治疗方法,因此,动脉粥样硬化斑块钙化的机制需要进一步深入研究。白细胞介素增强子结合因子 3（interleukin enhancer-binding factor 3,ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,可以和蛋白、mRNA、非编码RNA和双链RNA结合,调节他们的转录、翻译、mRNA的稳定性和非编码RNA的生物合成。在心血管系统中,研究发现ILF3参与心肌肥大的病理过程。基因组学研究发现ILF3的基因多态性和心肌梗死的发生密切相关,且这一过程分别受低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）代谢的影响。以上的研究表明 ILF3和多种心血管疾病的发生密切有关,但ILF3在VC尤其是动脉粥样硬化斑块钙化中的作用和机制仍无相关研究报道。目的（1）明确ILF3与动脉粥样硬化斑块钙化的发生相关;（2）探讨ILF3在VSMCs和巨噬细胞钙化中的作用;（3）阐明ILF3调节动脉粥样硬化斑块钙化的相关分子机制。方法（1）动物模型的建立VSMCs条件性敲除的小鼠（ILF3SM-KO）和巨噬细胞条件性敲除的小鼠（ILF3M-KO）是由ILF3敲除的floxed小鼠（ILF3flox/flox）分别和Sm22a-creERT2小鼠以及Lyz2-Cre小鼠杂交产生（LF3flox/flox/Cre+）。VSMCs条件性过表达的小鼠（ILF3SM-Tg）和巨噬细胞条件性过表达的小鼠（ILF3M-Tg）是由ILF3过表达的floxed小鼠（ILF3flox/flox）分别和Sm22a-creERT2小鼠以及Lyz2-Cre小鼠杂交产生（LF3flox/flox/Cre+）。ApoE-/-ILF3SM-KO,ApoE-/-ILF3SM-Tg,ApoE-/-ILF3M-KO和ApoE-/-ILF3M-Tg双敲除基因的小鼠是由ApoE-/-小鼠和LF3flox/flox/Cre+小鼠杂交产生。6周龄的ApoE-/-ILF3SM-KO小鼠和ApoE-/-ILF3SM-Tg小鼠接受持续腹腔注射他莫昔芬（75 mg/kg）5天。注射结束1周后,诱导creERT2表达。选取8周龄雄性小鼠,给予高脂喂养16周后建立动脉粥样硬化斑块钙化模型。（2）血清学检测分析高脂喂养16周,收集小鼠血液后离心,留血清,检测各组小鼠的甘油三酯（triglycerides,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、血糖（blood glucose,BG）、LDL-C、HDL-C、钙和磷含量。（3）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清中氧化低密度脂蛋白（oxidized LDL,ox-LDL）的水平。（4）免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色石蜡切片经过烤片、脱蜡、抗原修复液修复后置于10%的山羊血清中封闭1小时,然后一抗中孵育过夜。第二天,室温复温1小时,将片子孵育辣根过氧化物酶标记的二抗,然后显微镜下用DAB显色,拍照。免疫组织荧光染色步骤第一天同免疫组织化学染色,第二天用含荧光的二抗进行孵育,然后用DAPI染核,荧光显微镜下拍照。（5）细胞培养人主动脉平滑肌细胞（human aortic VSMCs,HAVSMCs）购于美国ScienCell公司。原代腹腔巨噬细胞从C57BL/6J小鼠（WT型）,ILF3M-KO和ILF3M-Tg小鼠腹腔中提取。用10mM的β-磷酸甘油（β-glycerophosphate,β-GP）刺激HAVSMCs及原代巨噬细胞建立体外细胞钙化模型。用ox-LDL（50 μg/ml）刺激HAVSMCs模拟体内高脂血症环境。（6）细胞转染ILF3过表达慢病毒和STAT1过表达腺病毒转染细胞,24小时后换液,病毒滴度为10。在opti培养基条件下,用人ILF3基因的siRNA、人BMP2基因的siRNA和小鼠BMP2基因的siRNA转染细胞,4-6小时后换液。（7）转录组测序将HAVSMCs用TRIzol提取出RNA,然后进行转录组测序,根据测序结果进行GO分析和KEGG分析。（8）细胞免疫荧光染色将细胞用4%多聚甲醛固定后,置于一抗中孵育过夜,第二天用含荧光的二抗孵育1小时,DAPI染核10分钟后封片,荧光显微镜下拍照。（9）蛋白印迹实验（western blot）将细胞收集,用RIPA裂解液裂解细胞,将提取的蛋白煮沸后用western blot的方法进行检测。（10）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）提取细胞RNA,进行逆转录,设计需检测mRNA的引物,进行RT-qPCR检测。（11）茜素红染色和Von Kossa染色将细胞用4%的多聚甲醛固定后浸入1%的茜素红染料中染15分钟;组织需脱蜡后浸入1%的茜素红染料中染5分钟;细胞固定后浸入5%的硝酸银溶液中同时曝光于紫外线下1小时。（12）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）的检测和钙含量检测用ALP检测试剂盒和钙含量检测试剂盒进行检测。（13）荧光素酶报告实验BMP2和STAT1的启动子区域整合到pGL3-basic载体中,然后将pGL3-BMP2和pGL3-STAT1整合到荧光素酶报告载体中。将以上质粒和海肾质粒共转染HEK293T细胞,24小时后用双重荧光素酶报告试剂盒进行荧光素酶和海肾的活性检测。（14）染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay,CHIP）蛋白-DNA结合物用CHIP试剂盒从HAVSMCs中提取,用ILF3抗体结合拉下DNA,然后针对启动子序列设计引物进行RT-qPCR检测和琼脂糖凝胶电泳。结果（1）ILF3在钙化的动脉粥样硬化斑块中高表达免疫组织化学染色结果示:ILF3在钙化的小鼠动脉粥样硬化斑块和人钙化血管中表达增高。茜素红染色和Von Kossa染色结果显示ox-LDL刺激HAVSMCs后,细胞出现明显的钙化结节,并伴随着ILF3在蛋白水平和mRNA水平表达的增加。（2）ILF3参与调节钙化相关基因的表达转录组测序结果显示ILF3的敲除导致684个基因下调和940个基因上调。GO分析和KEGG分析结果示ILF3和钙化相关心血管疾病以及钙化相关信号通路密切相关,且调控多种钙化相关基因的表达。我们用western blot和RT-qPCR检测发现:ILF3的敲除可以抑制钙化相关基因BMP2的表达,同时增加STAT1基因的表达。（3）ILF3促进动脉粥样硬化斑块中VSMCs的钙化动脉粥样硬化斑块钙化模型小鼠高脂食物喂养16周,与ApoE-/-小鼠比较,ApoE-/-ILF3SM-Tg小鼠的斑块出现明显钙化,同时,BMP2和Runx2的表达增多而STAT1的表达下调,而ApoE/-ILF3SM-KO小鼠表现出相反的趋势。在体外培养的HAVSMCs中,与对照组相比,ox-LDL刺激显著增加HAVSMCs的钙盐沉积、ALP活性和钙含量,而ILF3敲除显著抑制了 ox-LDL的促钙化作用。而过表达ILF3进一步加重了 HAVSMCs的钙化。Western blot结果显示ILF3引起钙化标志物BMP2和Runx2的表达增多和STAT1的表达下调。（4）ILF3促进钙化动脉粥样硬化斑块中VSMCs的表型转化Western blot结果显示ILF3促使VSMCs的收缩型标记物α-SMA下调和分泌型标记物OPN和Vimentin上调。在体内动脉粥样硬化斑块中,免疫组织荧光染色和免疫组织化学染色的结果显示ILF3促进VSMCs由收缩型向分泌型转化。（5）ILF3促进动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞钙化茜素红染色和Von Kossa染色结果显示ILF3的敲除减弱了ox-LDL引起的巨噬细胞的钙化、ALP活性的增高和钙含量的增加。相反,ILF3过表达进一步加剧巨噬细胞的钙化。另外,ILF3导致巨噬细胞钙化标志物BMP2和Runx2的过表达和STAT1的表达减弱。在小鼠动脉粥样硬化斑块中,ILF3导致巨噬细胞明显钙化,伴随着BMP2和Runx2表达增多和STAT1表达下调。我们用培养巨噬细胞的培养基孵育VSMCs,发现ILF3的敲除导致VSMCs钙化减弱和Runx2表达下调。（6）ILF3促进动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞极化在培养的巨噬细胞中,ox-LDL刺激巨噬细胞从M2型向M1型转化,而ILF3敲除逆转了这个过程。相反,ILF3过表达加剧巨噬细胞的极化。在ApoE-/-,ApoE-/-ILF3M-KO和ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠中,ILF3过表达引起巨噬细胞由M2型向M1型转化,ILF3敲除后逆转了这种变化。（7）ILF3通过上调BMP2介导高脂血症诱导的HAVSMCs和巨噬细胞钙化研究结果显示ILF3增加了 p-smad的水平和Runx2的表达,进而加剧VSMCs和巨噬细胞的钙化,而抑制BMP2可显著缓解ILF3介导的VSMCs和巨噬细胞的钙化。（8）ILF3通过下调STAT1的表达,促进高脂血症诱导的HAVSMCs和巨噬细胞钙化研究结果显示:ILF3通过下调STAT1表达促进了 Runx2的核转位,使HAVSMCs和巨噬细胞胞核中Runx2含量增加,进而加剧HAVSMCs和巨噬细胞的钙化,而过表达STAT1抑制ILF3介导Runx2核转位,进而缓解高脂血症诱导的HAVSMCs和巨噬细胞的钙化。（9）ILF3通过与启动子区域结合,调控BMP2和STAT1基因的表达荧光素酶检测结果发现:ILF3增加BMP2启动子荧光素酶活性和降低STAT1启动子荧光素酶活性。CHIP检测结果显示:ILF3直接和BMP2和STAT1基因的启动子区域结合。HADDOCK软件分析结果示:ILF3分别和BMP2基因启动子-53至-48 bp序列以及STAT1基因启动子-28至-23bp序列结合。结论（1）ILF3在钙化的动脉粥样硬化斑块中高表达,并参与高脂血症诱导的VSMCs和巨噬细胞的钙化;（2）ILF3通过调节VSMCs表型转化和巨噬细胞极化,参与动脉粥样硬化斑块的钙化;（3）ILF3通过与启动子区域直接结合调节BMP2和STAT1的转录活性,介导高脂血症诱导的VSMCs和巨噬细胞的钙化;（4）ILF3可能是预防和治疗动脉粥样硬化斑块钙化的潜在分子靶点。背景血管钙化（vascular calcification,VC）是发生在糖尿病（diabetes mellitus,DM）病人体内的一种普遍的病理现象,也是DM病人心血管死亡率较高的重要危险因素。其中,持续高血糖引起体内糖基化终末产物（advanced glycation end-productions,AGEs）的增加,并通过特异性AGEs受体介导糖尿病并发症的发生和发展。研究发现:DM条件下,AGEs可介导许多因素参与VC,包括炎症、氧化应激、细胞凋亡和无机磷代谢等。平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMCs）的行为改变在DM诱导的VC中发挥最主要的作用,其中,AGEs诱导VSMCs的表型转化以及VSMCs的凋亡是促进VC的重要因素。但到目前为止,DM促进AGEs的增加,加速VC的具体机制仍不清楚。AGEs是一种高糖诱导的、非酶调节的蛋白、脂质和核酸等发生糖基化反应的产物。通过和免疫球蛋白受体（AGEs receptor,RAGE）相互结合在DM诱导的VC中发挥重要作用。AGEs和RAGE结合将激活多种信号通路,参与DM诱发的动脉粥样斑块钙化。此外,在体内还存在另一种AGEs的跨膜受体（AGEs receptor 1,AGER1）,主要位于胞膜和内质网膜上,这种受体和AGEs的摄取和清除有关。由于AGER1和RAGE竞争性结合AGEs,所以两种受体介之间的平衡在DM钙化中至关重要。在DM病人及DM动物模型均中发现:随着血糖水平的升高,RAGE活性显著增加,而AGER1的活性显著降低,但导致这种改变的分子机制并不清楚。白细胞介素增强子结合因子 3（interleukin enhancer-binding factor 3,ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,参与调节DNA的转录、翻译、mRNA稳定性和非编码RNA的生物学功能。目前,有关ILF3在心血管疾病中的作用少有报道。研究发现ILF3通过影响血脂代谢参与调节心肌梗死,但ILF3和DM之间的关系目前仍无研究报道。ILF3是否参与AGEs的代谢,促进高糖诱导的动脉粥样斑块钙化需要进一步研究。另外,我们需探索ILF3参与DM动脉粥样斑块钙化是否和AGEs/RAGE或者AGEs/AGER1的代谢调节有关。目标（1）明确ILF3与DM动脉粥样硬化斑块钙化相关;（2）研究ILF3在DM动脉粥样硬化斑块钙化中的作用;（3）探索ILF3对高糖诱导的VSMCs表型转化和凋亡的影响;（4）阐明ILF3参与DM动脉粥样斑块钙化的具体分子机制。方法（1）动物模型的建立VSMCs条件性敲除的小鼠（ILF3SM-KO）由ILF3敲除的floxed小鼠（ILF3flox/flox）和Sm22a-creERT2小鼠杂交产生（LF3flox/flox/Cre+）。ApoE-/-ILF3SM-KO双敲基因的小鼠是通过ApoE-/-小鼠和ILF3flox/flox/Cre+小鼠杂交产生的。6周龄的ILF3SM-KO小鼠接受持续5天腹腔注射他莫昔芬（75 mg/kg）。注射结束1周后,诱导creERT2表达。所有8周龄雄性小鼠接受腹腔注射STZ（50 mg/kg）,持续5天,2周后连续检测两次随机血糖（blood glucose,BG）大于300 mg/dL,即为DM小鼠建模成功。所有10周龄雄性小鼠接受高脂喂养12周,建立糖尿病动脉粥样斑块钙化模型。（2）血清学检测分析对小鼠血清中甘油三酯（triglycerides,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、BG、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、钙和磷含量进行检测。（3）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）ELISA试剂盒用于检测小鼠血清中AGER1、AGEs和细胞上清中AGEs的水平。（4）免疫组织化学染色和和免疫荧光染色石蜡切片经历烤片、脱蜡、抗原修复液修复后,放在10%的山羊血清中封闭1小时,然后一抗中孵育过夜。第二天,室温复温1小时,将切片孵育辣根过氧化物酶标记的二抗,然后显微镜下DAB显色,拍照。免疫荧光染色第一天同免疫组织化学染色,第二天用含荧光的二抗进行孵育,然后用DAPI染核,荧光显微镜下拍照。（5）细胞培养人主动脉平滑肌细胞（human aortic VSMCs,HAVSMCs）购于美国ScienCell公司。用 10 mM 的 β-磷酸甘油（β-glycerophosphate,β-GP）刺激 HAVSMCs 建立体外细胞钙化模型。分别用27.5 mM高糖、AGEs（200 mg/ml）、抗RAGE中和抗体、50 mg/ml 放线菌酮（cycloheximide,CHX）和 MG132（10 μmol/L）刺激 HAVSMCs。（6）质粒、小干扰和病毒的合成Homo-ILF3-Flag、Homo-AGER1-myc、HA-ubiquitin 质粒、人ILF3 siRNA和ILF3慢病毒由吉凯基因合成和提供。（7）细胞转染慢病毒以滴度10转染细胞,24小时后换液。小干扰（siRNA）和质粒转染细胞,需要在opti培养基和lip3000/p3000条件下,4-6小时后换液。（8）细胞免疫荧光将细胞用4%多聚甲醛固定后,置于一抗中孵育过夜,第二天用含荧光的二抗孵育细胞1小时,DAPI染核10分钟后封片,荧光显微镜下拍照。（9）蛋白印实验迹（western blot）将细胞收集,用RIPA裂解液裂解细胞,将提取的蛋白煮沸后用western blot的方法进行检测。（10）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）提取细胞RNA,进行逆转录,设计需检测mRNA的引物,进行RT-qPCR检测。（11）茜素红染色和Von Kossa染色将细胞用4%的多聚甲醛固定后浸入1%的茜素红染料中染色15分钟;组织需脱蜡后浸入1%的茜素红染料中染色5分钟;细胞固定后浸入5%的Von Kossa溶液中同时曝光于紫外线下1小时。（12）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性的检测和钙含量检测用ALP检测试剂盒和钙含量检测试剂盒进行检测。（13）TUNEL 染色用TUNEL试剂盒对体外培养的VSMCs和斑块中的VSMCs进行染色,图片用荧光显微镜拍照获得。（14）MVs的检测细胞培养基被收集后用胶原酶消化5分钟,10000 rpm离心30分钟获得细胞和凋亡小体。重悬沉淀后再次离心,100000 rpm离心30分钟后用1%Triton X-100重悬以获取凋亡小体。BCA检测法检测凋亡小体的含量。（15）流式细胞检测待细胞被收集后,用Annexin V和7-AAD进行染色,流式细胞仪上机检测。（16）蛋白免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）用Co-IP试剂盒提取蛋白-蛋白复合物,然后用western blot进行检测。结果（1）ILF3在体内外高糖条件下高表达茜素红和Von Kossa染色结果提示高糖诱导HAVSMCs的钙化,同时伴随着ILF3在蛋白和mRNA水平表达增多。细胞免疫荧光染色结果示高糖促使ILF3在核中的表达明显上调,部分ILF3从胞核向胞浆转位。在DM诱导的钙化的动脉粥样斑块中,ILF3表达也明显上调。（2）ILF3基因敲除抑制DM诱发的动脉粥样斑块钙化研究发现ILF3的敲除抑制了高糖诱发的HAVSMCs钙盐的沉积、ALP活性的增加和钙含量的增多,伴随着BMP2和Runx2表达的下调。在体内,DM引起了动脉粥样斑块的钙化以及BMP2和Runx2表达增多,但ILF3的敲除逆转了这一现象。（3）ILF3基因敲除抑制VSMCs的表型转化高糖促进HAVSMCs由收缩型向成骨型转化,但ILF3的敲除抑制了HAVSMCs的表型转化。VSMCs的免疫荧光染色也证实了这一观点。对钙化的动脉粥样斑块进行免疫荧光染色发现ILF3的敲除抑制了 VSMCs的表型转化。（4）ILF3基因敲除抑制VSMCs的凋亡和MVs的释放TUNEL染色发现高糖在体内和体外都诱导VSMCs的凋亡,但ILF3敲除减弱了高糖的促凋亡作用。Western blot结果显示ILF3敲除减弱了高糖引起的促凋亡指标增加和抑凋亡指标的降低。同样,流式结果显示高糖促进HAVSMCs的凋亡,但ILF3敲除减弱了高糖的作用。ILF3敲除也抑制高糖诱导的MVs的释放。（5）ILF3基因敲除通过抑制AGEs/RAGE信号通路减弱高糖诱导的VSMCs的钙化高糖促进AGEs/RAGE信号通路下游信号分子的激活,但ILF3的敲除抑制了 AGEs/RAGE信号通路下游信号分子的激活。用AGEs刺激HAVSMCs后发现AGEs促进VSMCs Runx2的表达和钙化,而敲除ILF3后,AGEs诱导的VSMCs Runx2的表达和钙化被减弱。同时抗RAGE中和抗体的应用减弱了 ILF3过表达引起的Runx2表达上调和VSMCs的钙化。（6）ILF3介导AGEs/RAGE信号通路通过增加AGEs的清除而不影响RAGE的表达RT-qPCR和western blot研究发现高糖刺激RAGE的表达,但无论ILF3的敲除或者过表达对RAGE表达无影响。Co-IP的结果表明ILF3不能直接和RAGE结合。我们对小鼠血清和培养基中AGEs水平进行检测发现ILF3的敲除导致AGEs含量下降,而过表达ILF3引起AGEs水平升高。我们用AGEs刺激HAVSMCs,细胞免疫荧光染色得到同样的结果。（7）ILF3通过促进AGER1的泛素化降解减少对AGEs的清除作用ELISA检测发现在DM小鼠血清中,AGER1的含量明显下降,而在ILF3敲除的DM小鼠血清中AGER1含量明显增加。Western blot结果示ILF3导致AGER1蛋白水平的下降,RT-qPCR检测发现ILF3对AGER1 mRNA水平无影响,表明ILF3可能影响AGER1蛋白的降解。MG132和CHX的应用表明ILF3促进AGER1经蛋白酶途径降解。Co-IP和western blot检测发现ILF3促进AGER1发生泛素化。结果表明ILF3促进AGER1经泛素化-蛋白酶途径降解。结论（1）ILF3在高糖诱导的HAVSMCs和DM动脉粥样斑块中高表达;（2）ILF3基因敲除可抑制高血糖诱导的VSMCs表型转化和凋亡,改善DM动脉粥样斑块钙化;（3）ILF3基因敲除通过增强AGER1活性,促进细胞AGEs的降解,改善DM动脉粥样斑块钙化;;（4）高血糖通过激活ILF3加速AGER1的泛素化降解,促进体内AGEs积累,进而加速DM动脉粥样斑块钙化;（5）ILF3基因敲除可能成为抑制糖尿病动脉粥样斑块钙化的有效分子靶点。