神经系统发育过程中最精妙之处,莫过于整个神经环路的形成。而神经环路的形成,需要轴突精确地到达靶标位点,与其它神经元建立突触联系,形成相应的功能性神经网络。如果轴突投射出现错误,将导致神经元信息无法准确地传递,使得神经系统的功能发生紊乱,出现一系列神经疾病。轴突导向因子(Axon guidance cues),是一些可以对轴突的投射活动进行调节和导向的蛋白。经典轴突导向因子可以分为四大类,分别为Slits、Netrins、Ephrins、Semaphorins[1]。它们通过与轴突末端生长锥上的受体与轴突内部相关蛋白相互作用,感知轴突外部微环境,调节轴突内细胞骨架蛋白的动态组装和解聚,从而导致生长锥延伸、塌缩、分支、转向等转变,最终引导轴突到达靶标位置,形成突触联系。众多轴突导向因子的结构和功能已被发现,但其胞内信号传导机制的研究尚处于起始阶段。Semaphorins是一类重要的轴突导向因子,其中III型蛋白Semaphorin3A,因能够介导轴突生长锥的塌缩,最初被命名为Collapsin[2]。Semaphorin3A通过其受体Plexins和共受体neuropilins将胞外信号传递到胞内,再通过胞内蛋白进行信号传导。进一步研究发现一类蛋白能够介导Collapsin的塌缩反应,命名为 CRMPs(Collapsin Response Mediator Proteins)[3]。CRMPs是一类细胞内磷酸化蛋白,它们在早期小鼠胚胎发育脑区均存在特异性表达[4]。在脊椎动物体内,CRMPs包括CRMP1,CRMP2,CRMP3,CRMP4,CRMP5五种。其中CRMP1、CRMP2、CRMP4均存在选择性拼接,导致第一个外显子不同,翻译产生不同N末端的蛋白质[5]。目前关于CRMPs在神经元的形态和功能方面的研究很多,然而大多数都是体外实验结果,体内的研究很少。特别是CRMPs在轴突导向中的作用以及选择性拼接体的作用更是知之甚少。本论文通过使用斑马鱼作为实验动物,研究CRMPs尤其是CRMP4在斑马鱼神经环路发育中的作用。我们首先通过反转录PCR、TA克隆等技术方法,得到一些斑马鱼体内CRMPs的cDNA,并在体外进行转录制备原位杂交探针。再根据原位杂交结果分析CRMPs在斑马鱼胚胎发育过程中可能存在的功能。为区分CRMP4选择性剪接体,我们分别针对不同剪接体制备了 CRMP4a和CRMP4b的两种特异探针以及能同时识别两种拼接体的探针CRMP4。通过对原位杂交结果进行分析,我们发现CRMP4a在斑马鱼早期神经发育过程中有非常强烈的表达,并且其表达图式和CRMP4极其类似。然而CRMP4b几乎检测不到明显特异性表达。这预示着在斑马鱼体内,CRMP4基因在早期神经发育过程中主要通过CRMP4a行使其功能。此外,我们还发现CRMP4在斑马鱼视神经节细胞(Retinal ganglion cell,RGC)内有特异性表达分布,并随着RGC轴突向视顶盖投射过程中表达量不断增加。这提示CRMP4可能参与视神经轴突的导向,为我们通过视神经投射模型研究CRMPs在轴突导向中的作用提供基础。最后,我们运用显微注射技术,将CRMP4a特异性的反义核苷酸Morpholino注射到斑马鱼受精卵中,以敲减CRMP4a基因。运用经典的研究轴突导向的视神经投射模型,我们发现敲减CRMP4a导致RGC轴突投射出现障碍,部分视神经不能正确穿越中线,而是错误投射到同侧脑区,同时发现部分胚胎中视神经轴突数量减少。为进一步研究其相关机制,我们通过对CRMP4a和Semaphorin共受体Nrp1a进行半剂量共敲减实验,在体发现CRMP4a可能参与Semaphorins诱导的轴突生长和导向过程。