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甘蔗是中国主要的糖料作物,干旱是限制可持续甘蔗生产的最具挑战性的农业问题之一。ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)是植物生长发育中的关键酶,其功能之一是能够提高植物的抗逆性,SoACLA-1基因是编码甘蔗ATP-柠檬酸裂解酶蛋白的一个亚基的基因。本课题组前期构建了以玉米ubi为启动子的SoACLA-1基因的真核表达载体PUBTC-SoACLA-1,并利用农杆菌转化法将该载体转入甘蔗品种ROC22中,获得了转SoACLA-1基因甘蔗无性系。本研究是以野生型甘蔗品种ROC22和上述转基因甘蔗品系的T1、T2代作为材料,研究过量表达SoACLA-1基因在干旱胁迫和复水时对甘蔗相关生理生化指标的影响以及在不同胁迫天数下SoACLA-1基因和几个响应植物干旱胁迫的基因的表达情况,为评价转SoACLA-1基因甘蔗的遗传稳定性及验证SoACLA-1基因的功能提供参考。研究内容及结果如下:1.导入的SoACLA-1基因在T1、T2代转基因甘蔗中均发现有丢失现象。利用PCR扩增标记基因bar基因并测序,结果表明31个阳性转基因甘蔗品系在T1代中有25个品系能检测到bar基因,而在T2代中则有21个品系能检测到bar基因,即T1代的转基因阳性率为80.6%,T2代的转基因阳性率为84%。2.RT-PCR及抗除草剂筛选进一步验证了转基因甘蔗材料。利用RT-PCR对转SoACLA-1基因甘蔗进行检测,结果表明导入的SoACLA-1基因能在mRNA水平上高效表达。经过除草剂抗性筛选发现,带有标记基因bar基因的转SoACLA-1基因甘蔗具有除草剂抗性。3.SoACLA-1基因能够提高T1代转基因甘蔗的抗旱性。在甘蔗伸长初期对转SoACLA-1基因甘蔗RT1、RT2、RT3、RT4和野生型甘蔗(WT)进行0、3、6、9 d和复水3 d的干旱胁迫处理并利用模糊数学中的隶属函数对叶绿素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等与抗旱性相关的4个指标进行综合评价,结果表明,5个甘蔗品系T1代抗旱性由强到弱依次为RT2>RT4>RT3>RT1>WT,旱后恢复能力由强到弱依次为RT1>RT2>RT4>RT3>WT;转基因甘蔗品系RT2的SOD活性在整个干旱胁迫及复水过程中均维持在高于其他几个转基因品系及WT的水平,从POD活性来看,整个干旱胁迫过程转基因品系RT4的POD活性均高于其他几个品系,而RT2的POD活性在胁迫中后期升幅较大并显著高于WT(P<0.05)。在胁迫9d时,转基因品系的SoACLA-1基因表达量均高于WT。4.SoACLA-1基因能够提高T2代转基因甘蔗的抗旱性且SoACLA-1在转基因甘蔗中的胁迫诱导表达导致响应植物干旱胁迫的基因的上调。在甘蔗伸长末期对转SoACLA-1基因甘蔗RT2、RT4品系和野生型甘蔗(WT)进行干旱胁迫和复水处理,分别在干旱胁迫0、6、9 d和复水3d采集叶片进行分析,并利用模糊数学中的隶属函数对叶绿素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等与抗旱性相关的4个指标进行综合评价,结果表明,3个甘蔗品系的T2代抗旱性由强到弱依次为RT4>RT2>WT,旱后恢复能力由强到弱依次为RT2>RT4>WT;转基因甘蔗品系RT2的SOD活性在干旱胁迫9 d和复水3 d时显著高于WT,而RT2和RT4的POD活性在胁迫9 d均表现为显著高于WT。从实时荧光定量PCR的结果来看,SoACLA-1基因和SCDR4基因在胁迫6 d时的表达量最高,且RT2与RT4在此时的SoACLA-1基因和SCDR4基因的表达量均显著高于WT;P5CS基因与dhy基因的表达量则是在胁迫9 d时最高,且RT2与RT4此时的dhy基因显著高于WT,而RT2的P5CS基因表达量在胁迫9 d时显著高于WT。RT2品系的Cu/Zn-SOD基因表达量在胁迫6 d时高于WT,而RT4品系则是在9d是显著高于WT。可见,转SoACLA-1基因甘蔗T2代干旱胁迫后的生理生化指标的变化与几个响应干旱胁迫的基因表达具有一定的相关性。5.综合分析T1、T2代甘蔗的遗传稳定性及SoACLA-1基因的功能,得出SoACLA-1基因在甘蔗中虽有丢失现象,但随着代数的增加可能会趋于稳定,转基因甘蔗能够稳定高效地表达bar基因和SoACLA-1基因,目标性状在T1、T2代中均得以表现说明其目标性状也能稳定遗传,转基因甘蔗的抗旱性强于非转基因甘蔗证明Soo4CLA-1基因具有提高抗旱性的功能。