疾病关键代谢物溶血磷脂酰胆碱及未衍生化神经递质的dSPE-LC-MS/MS技术检测方法研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:liuchunxi
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目的:  为了可以精确检测健康大鼠脑组织中的溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)和神经递质,将LC-MS/MS技术与分散固相萃取方法(dispersed solid phase extraction,dSPE)结合,并开展样品预处理优化工作,建立一个快速、重复性好,回收率高,成本低的检测方法。其中被检测的溶血磷脂酰胆碱为:LPC(16∶0),LPC(18∶0),LPC(18∶1),LPC(20∶4),LPC(22∶6);神经递质为:多巴胺(dopamine,DA),2-羟苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid DOPAC),5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA),谷氨酰胺(Glutamine,GLN),γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。  方法:  (1)通过质谱直接进样及液质联用技术(LC-MS/MS),采用标准品优化每个分析物的质谱参数和液相色谱条件。  (2)通过LC-MS/MS技术,采用标准品及组织样品优化样品预处理过程中的各步骤确定最佳的dSPE方案。具体步骤包括:固相萃取物质的选择,固相萃取物质粒径及用量的选择,样品复溶溶液的选择,复溶溶液有机相及有机相比例的选择,复溶溶液pH的选择,样品上清液的稀释溶剂,沉淀物的洗脱溶剂和洗脱溶剂的pH的选择。  (3)通过方法学验证,考察dSPE-LC-MS/MS方法的线性范围,检测限,定量限,基质效应(绝对回收率),回收率以及日内和日间精密度。  结果:  (1)通过质谱直接进样及LC-MS/MS技术,运用各物质的标准品获得LPC和神经递质的MRM条件,包括各物质的前体/产物离子对及其DP、EP、CEP、CE、CXP等。  (2)从固相萃取物质的萃取率及实验的成本来看,C18分散颗粒作为最终佳的实验固相萃取材料。通过比较不同粒径的萃取率,10μm C18分散颗粒萃取LPC(12∶0)的效率最高,萃取率为56%。C18固相材料的具体使用量为:10mg C18颗粒适用于GABA和GLN,它们的萃取率均在98%以上。25mg C18颗粒适用于其他化合物,它们的萃取率为95%-100%。  (3)从各物质的信号响应强度及在不同酸碱环境下的稳定程度来看,5%的MeOH-水(0.1%FA)作为最适合的复溶溶剂,IPA作为固相萃取组织样品的稀释溶剂,IPA(0.1%FA)作为沉渣的洗脱溶剂。  (4)5-HT,DA,GABA,GLN的标准线性范围为10-1000ng/mL,5-HIAA,DOPAC,LPC的标准线性范围为50-1000ng/mL。通过考察方法的回收率,7种化合物在低中高3个浓度范围内的平均回收率为65.17%-11489%,CV为0.00%-8.68%。即所有化合物的回收率高于65%,偏差小于8.68%。日内精密度的变异系数在0.20%-14.7%之间,日间精密度变化小于9.21%,变异系数在0.18%-9.21%之间。  结论:  本研究建立的dSPE-LC-MS/MS技术用于检测溶血磷脂酰胆碱和六种神经递质得到了验证。结果表明,该方法简单,未采用任何衍生化手段,灵敏度高,便于检测大鼠脑生物样品中的溶血磷脂酰胆碱和神经递质。该实验适合用于医用实验室的检测。此外,神经递质和溶血磷脂酰胆碱与抑郁症等精神疾病有关,本实验建立的方法可为研究某些精神疾病的方法提供借鉴思路。
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