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通过对胶质瘤临床样本及数据库（TCGA）、Rembrandt和Gravendel深入分析表明ZYXIN的高表达与胶质瘤患者的肿瘤进展和预后不良密切相关；体外和体内实验进一步证实ZYXIN促进了GBM的侵袭；对敲低ZYXIN的GBM细胞系LN229及其对照细胞的RNA-Seq和itraq检测结果分析显示，STMN1是ZYXIN的潜在作用靶点。事实上，STMN1的mRNA和蛋白水平都与ZYXIN的表达呈正相关。在功能上，过表达的STMN1不仅能促进GBM细胞的侵袭能力，而且能明显回复ZYXIN敲低引起的迁移和侵袭的抑制作用。综上所述，我们的研究结果表明，在GBM中，ZYXIN高表达与GBM的病情进展和不良预后密切相关；ZYXIN能促进GBM细胞的侵袭；ZYXIN通过调控STMN1从而促进GBM的侵袭，ZYXIN-STMN1轴可被视为GBM的潜在的治疗靶点。
主要结果和结论如下：
1.筛选出ZYXIN，探讨其在GBM中的表达及与患者预后的关系。
1.1ZYXIN作为GBM细胞的侵袭性标志物的候选基因的筛选。
为了研究GBM中可能作为细胞迁移和侵袭标志物的候选基因，首先分析了三个与侵袭相关的基因集，即KEGG FOCAL ADHESION、GO CELL SUBSTRATE ADHESION和GO CELL SUBSTRATE JUNCTION。三个基因集中的基因都能通过调控细胞与细胞外基质的相互作用而在肿瘤侵袭中发挥重要作用。韦恩图显示，有26个基因共同存在于这三个基因集中。为了进一步评估这26个基因在GBM侵袭中的潜在作用，在两个广泛使用的GBM公共数据库TCGA-GBM和Rembrandt中比较了它们在瘤和瘤旁组织中的表达差异，发现ZYXIN在这两个数据库中都是差异最为显著的。提示ZYXIN可能是调控GBM细胞迁移和侵袭的关键分子。然后，检测了以HEB（人正常星形胶质细胞系）为对照的一组GBM细胞系及原代胶质瘤细胞株中ZYXIN的mRNA和蛋白的表达。结果表明，GBM细胞系及原代胶质瘤细胞株中的ZYXIN的mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常星形胶质细胞HEB。此外，还收集了6例新切除的肿瘤组织及其相邻的非肿瘤组织临床样本。与细胞学结果相一致，肿瘤组织中ZYXIN蛋白表达水平明显高于其相邻的非肿瘤组织。因此，有理由相信ZYXIN很可能是一个GBM侵袭标志物的候选基因。
1.2ZYXIN的升高与胶质瘤患者的病情进展和预后不良密切相关。
为了深入探讨ZYXIN在胶质瘤中的病理相关性，分析了不同级别弥漫性胶质瘤（包括WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ级）的临床样本中ZYXIN的表达。免疫组化结果分析显示，在84例胶质瘤患者中，ZYXIN蛋白的表达随WHO级别的增加有增多的趋势。在12例新鲜胶质瘤临床样本中，通过WB检测，也得出与上述一致的结论。接下来，对TCGA_GBMLGG、Rembrandt和Grevendeel三个公共胶质瘤数据库的分析结果也显示，ZYXIN的mRNA表达水平也随WHO级别的增加有增多的趋势。此外，三个数据库的Kaplan-Meier生存曲线分析也表明无论是在所有胶质瘤还是在GBM中，ZYXIN mRNA表达水平高的患者的总生存率（OS）都显著低于表达水平低的患者，综上所述，ZYXIN的高表达与患者病情进展和预后不良密切相关。
2.RNA-Seq检测和数据库生物信息学分析结果显示ZYXIN能促进胶质母细胞瘤的侵袭。
由于ZYXIN在细胞与细胞外基质相互作用中起着关键作用，推测ZYXIN可能通过促进GBM细胞的侵袭而导致肿瘤的进展及不良预后。为了验证这一假设，稳定地敲低GBM细胞株LN229细胞中的ZYXIN，成功建立了ZYXIN稳定敲低细胞模型LN229/shZYXIN#1，并转染含scramble病毒建立对照组LN229/Ctrl。对LN229/shZYXIN#1和LN229/Ctrl细胞进行mRNA表达谱（RNA-Seq）测定，结果显示，ZYXIN敲低导致了489个基因表达上调，219个基因表达下调（P＜0.05，倍数≥2）。对差异基因进行基因本体（Go）分析，结果显示ZYXIN敲低后显著改变的基因主要富集在细胞迁移和侵袭相关的基因集中，这些基因集主要涉及细胞粘附、整合素介导的信号通路、细胞外基质重组和细胞与细胞外基质等生物学过程中。基因集富集分析（GSEA）结果进一步表明，ZYXIN的表达水平与胶质瘤侵袭相关的基因呈正相关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果显示，差异基因也明显富集在与调控细胞粘附和运动的关键信号通路中，包括Cell adhesion molecules(CAMs)、ECM?receptor interaction、Focal adhesion及PI3K?Akt signaling pathway等。同时，对公共数据库资料也进行了相应的GSEA分析，结果与上述一致，即ZYXIN mRNA高表达组能显著富集到胶质瘤侵袭和迁移相关的基因。综上所述，自己的实验结果和公共数据库分析结果都支持ZYXIN能促进GBM细胞的侵袭。
3.体内和体外实验证实敲低ZYXIN可降低GBM细胞的迁移和侵袭能力。
首先通过CCK-8实验证实了敲低ZYXIN并不明显改变LN229和GBM1细胞的体外增殖能力，排除了细胞增殖对实验结果的影响。接下来，通过Transwell实验观察了ZYXIN在体外对GBM细胞迁移和侵袭的影响，结果表明，ZYXIN敲低可显著抑制血清诱导的肿瘤细胞的迁移和侵袭。接下来，用上述两组敲低细胞在NOD-SCID小鼠体内建立了原位移植瘤模型以观察ZYXIN敲低对GBM细胞在体内侵袭能力的影响。对移植瘤的组织样本进行HE染色，结果显示，ZYXIN敲低组形成的移植瘤边缘光滑，肿瘤和非肿瘤区域分界清晰，而对照组形成的肿瘤边缘有明显的肿瘤细胞浸润进入非肿瘤区。肿瘤和非肿瘤交界区ZYXIN的IHC染色表明，ZYXIN在GBM1/Ctrl细胞形成的移植瘤浸润前沿有更高的表达。荷瘤小鼠生存期分析结果显示ZYXIN敲低组小鼠的存活时间明显长于对照组。综上所述，体内和体外实验均证实了ZYXIN能明显促进GBM细胞的迁移和侵袭能力。
4.探讨ZYXIN促进GBM侵袭的机制。
4.1ZYXIN在GBM中调控STMN1的转录。
为了探索ZYXIN在GBM中介导侵袭的机制，利用LN229/ctrl和LN229/shZYXIN#1细胞进行了基于itraq的质谱分析。通过对itraq与RNA-Seq检测结果进行联合分析，找出了与ZYXIN的mRNA和蛋白变化方向一致且变化最为显著的六个分子，其中共同上调的2个即GANAB和YWHAE，共同下调的4个即STMN1、ITGA4、SRM和ASNS。接下来通过qRT-PCR进一步验证了以上结果。通过广泛查阅相关文献，发现和ZYXIN共同下调的四个分子中的STMN1，它也是一种骨架相关蛋白，称之为微管不稳定蛋白，很多研究证实它在多种恶性肿瘤的侵袭中发挥了重要作用，而其余三个分子在GBM中研究的很少，因此，在GBM中进一步探讨了ZYXIN与STMN1的关系。Western blott检测结果显示，在LN229和GBM1细胞中敲低ZYXIN能引起STMN1蛋白表达显著下调，这与itraq结果相一致。此外，细胞免疫荧光实验结果也证实，ZYXIN敲低组细胞中STMN1的蛋白表达降低。对临床样本的免疫组化结果进行Pearson相关分析，结果表明在胶质瘤中ZYXIN与STMN1的蛋白表达呈正相关。又通过双荧光素酶报告基因实验证实，在GBM细胞中ZYXIN的表达与STMN1的转录呈正相关。综上所述，在GBM中，ZYXIN正向调控STMN1的转录。为了进一步评估它们二者的这种正向调控关系，利用数据库资料在GBM各个亚型中分析了它们的表达量及相关性，结果显示ZYXIN和STMN1在GBM各个亚型中的表达量的分布并不完全一致，而且上述的正向调控关系只在经典亚型和前神经元型中存在。综上所述，ZYXIN在GBM中正向调控STMN1的转录，而且这种调控关系受肿瘤基因背景的影响。
4.2.STMN1在GBM细胞中可能作为ZYXIN的下游靶点发挥作用。
既然ZYXIN在GBM细胞中能正向调控STMN1的转录，想知道是否STMN1过表达能在功能上回复ZYXIN敲低所致的GBM细胞迁移和侵袭的抑制。为此，在LN229/ctrl、LN229/shZYXIN#1、GBM1/ctrl和GBM1/shZYXIN#1中分别转入STMN1过表达病毒和对照病毒。对转染成功并经过流式细胞仪筛选的细胞进行transwell实验，结果表明，STMN1的过表达不仅能增加GBM细胞的迁移和侵袭能力，而且能明显回复ZYXIN敲低导致的迁移和侵袭的抑制作用。综上所述，我们的研究结果表明，在GBM细胞中，STMN1可能是ZYXIN发挥促侵袭作用的下游靶点。
在本研究中，可以得出以下结论：
（1）ZYXIN在GBM中显著增加，并且具有重要的预后价值，可用作一种新的肿瘤侵袭的生物标志物。
（2）ZYXIN是影响GBM细胞的体内、体外侵袭的重要分子，能促进GBM进展。
（3）ZYXIN通过调控STMN1的转录从而促进GBM细胞的迁移和侵袭。
主要结果和结论如下：
1.筛选出ZYXIN，探讨其在GBM中的表达及与患者预后的关系。
1.1ZYXIN作为GBM细胞的侵袭性标志物的候选基因的筛选。
为了研究GBM中可能作为细胞迁移和侵袭标志物的候选基因，首先分析了三个与侵袭相关的基因集，即KEGG FOCAL ADHESION、GO CELL SUBSTRATE ADHESION和GO CELL SUBSTRATE JUNCTION。三个基因集中的基因都能通过调控细胞与细胞外基质的相互作用而在肿瘤侵袭中发挥重要作用。韦恩图显示，有26个基因共同存在于这三个基因集中。为了进一步评估这26个基因在GBM侵袭中的潜在作用，在两个广泛使用的GBM公共数据库TCGA-GBM和Rembrandt中比较了它们在瘤和瘤旁组织中的表达差异，发现ZYXIN在这两个数据库中都是差异最为显著的。提示ZYXIN可能是调控GBM细胞迁移和侵袭的关键分子。然后，检测了以HEB（人正常星形胶质细胞系）为对照的一组GBM细胞系及原代胶质瘤细胞株中ZYXIN的mRNA和蛋白的表达。结果表明，GBM细胞系及原代胶质瘤细胞株中的ZYXIN的mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常星形胶质细胞HEB。此外，还收集了6例新切除的肿瘤组织及其相邻的非肿瘤组织临床样本。与细胞学结果相一致，肿瘤组织中ZYXIN蛋白表达水平明显高于其相邻的非肿瘤组织。因此，有理由相信ZYXIN很可能是一个GBM侵袭标志物的候选基因。
1.2ZYXIN的升高与胶质瘤患者的病情进展和预后不良密切相关。
为了深入探讨ZYXIN在胶质瘤中的病理相关性，分析了不同级别弥漫性胶质瘤（包括WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ级）的临床样本中ZYXIN的表达。免疫组化结果分析显示，在84例胶质瘤患者中，ZYXIN蛋白的表达随WHO级别的增加有增多的趋势。在12例新鲜胶质瘤临床样本中，通过WB检测，也得出与上述一致的结论。接下来，对TCGA_GBMLGG、Rembrandt和Grevendeel三个公共胶质瘤数据库的分析结果也显示，ZYXIN的mRNA表达水平也随WHO级别的增加有增多的趋势。此外，三个数据库的Kaplan-Meier生存曲线分析也表明无论是在所有胶质瘤还是在GBM中，ZYXIN mRNA表达水平高的患者的总生存率（OS）都显著低于表达水平低的患者，综上所述，ZYXIN的高表达与患者病情进展和预后不良密切相关。
2.RNA-Seq检测和数据库生物信息学分析结果显示ZYXIN能促进胶质母细胞瘤的侵袭。
由于ZYXIN在细胞与细胞外基质相互作用中起着关键作用，推测ZYXIN可能通过促进GBM细胞的侵袭而导致肿瘤的进展及不良预后。为了验证这一假设，稳定地敲低GBM细胞株LN229细胞中的ZYXIN，成功建立了ZYXIN稳定敲低细胞模型LN229/shZYXIN#1，并转染含scramble病毒建立对照组LN229/Ctrl。对LN229/shZYXIN#1和LN229/Ctrl细胞进行mRNA表达谱（RNA-Seq）测定，结果显示，ZYXIN敲低导致了489个基因表达上调，219个基因表达下调（P＜0.05，倍数≥2）。对差异基因进行基因本体（Go）分析，结果显示ZYXIN敲低后显著改变的基因主要富集在细胞迁移和侵袭相关的基因集中，这些基因集主要涉及细胞粘附、整合素介导的信号通路、细胞外基质重组和细胞与细胞外基质等生物学过程中。基因集富集分析（GSEA）结果进一步表明，ZYXIN的表达水平与胶质瘤侵袭相关的基因呈正相关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果显示，差异基因也明显富集在与调控细胞粘附和运动的关键信号通路中，包括Cell adhesion molecules(CAMs)、ECM?receptor interaction、Focal adhesion及PI3K?Akt signaling pathway等。同时，对公共数据库资料也进行了相应的GSEA分析，结果与上述一致，即ZYXIN mRNA高表达组能显著富集到胶质瘤侵袭和迁移相关的基因。综上所述，自己的实验结果和公共数据库分析结果都支持ZYXIN能促进GBM细胞的侵袭。
3.体内和体外实验证实敲低ZYXIN可降低GBM细胞的迁移和侵袭能力。
首先通过CCK-8实验证实了敲低ZYXIN并不明显改变LN229和GBM1细胞的体外增殖能力，排除了细胞增殖对实验结果的影响。接下来，通过Transwell实验观察了ZYXIN在体外对GBM细胞迁移和侵袭的影响，结果表明，ZYXIN敲低可显著抑制血清诱导的肿瘤细胞的迁移和侵袭。接下来，用上述两组敲低细胞在NOD-SCID小鼠体内建立了原位移植瘤模型以观察ZYXIN敲低对GBM细胞在体内侵袭能力的影响。对移植瘤的组织样本进行HE染色，结果显示，ZYXIN敲低组形成的移植瘤边缘光滑，肿瘤和非肿瘤区域分界清晰，而对照组形成的肿瘤边缘有明显的肿瘤细胞浸润进入非肿瘤区。肿瘤和非肿瘤交界区ZYXIN的IHC染色表明，ZYXIN在GBM1/Ctrl细胞形成的移植瘤浸润前沿有更高的表达。荷瘤小鼠生存期分析结果显示ZYXIN敲低组小鼠的存活时间明显长于对照组。综上所述，体内和体外实验均证实了ZYXIN能明显促进GBM细胞的迁移和侵袭能力。
4.探讨ZYXIN促进GBM侵袭的机制。
4.1ZYXIN在GBM中调控STMN1的转录。
为了探索ZYXIN在GBM中介导侵袭的机制，利用LN229/ctrl和LN229/shZYXIN#1细胞进行了基于itraq的质谱分析。通过对itraq与RNA-Seq检测结果进行联合分析，找出了与ZYXIN的mRNA和蛋白变化方向一致且变化最为显著的六个分子，其中共同上调的2个即GANAB和YWHAE，共同下调的4个即STMN1、ITGA4、SRM和ASNS。接下来通过qRT-PCR进一步验证了以上结果。通过广泛查阅相关文献，发现和ZYXIN共同下调的四个分子中的STMN1，它也是一种骨架相关蛋白，称之为微管不稳定蛋白，很多研究证实它在多种恶性肿瘤的侵袭中发挥了重要作用，而其余三个分子在GBM中研究的很少，因此，在GBM中进一步探讨了ZYXIN与STMN1的关系。Western blott检测结果显示，在LN229和GBM1细胞中敲低ZYXIN能引起STMN1蛋白表达显著下调，这与itraq结果相一致。此外，细胞免疫荧光实验结果也证实，ZYXIN敲低组细胞中STMN1的蛋白表达降低。对临床样本的免疫组化结果进行Pearson相关分析，结果表明在胶质瘤中ZYXIN与STMN1的蛋白表达呈正相关。又通过双荧光素酶报告基因实验证实，在GBM细胞中ZYXIN的表达与STMN1的转录呈正相关。综上所述，在GBM中，ZYXIN正向调控STMN1的转录。为了进一步评估它们二者的这种正向调控关系，利用数据库资料在GBM各个亚型中分析了它们的表达量及相关性，结果显示ZYXIN和STMN1在GBM各个亚型中的表达量的分布并不完全一致，而且上述的正向调控关系只在经典亚型和前神经元型中存在。综上所述，ZYXIN在GBM中正向调控STMN1的转录，而且这种调控关系受肿瘤基因背景的影响。
4.2.STMN1在GBM细胞中可能作为ZYXIN的下游靶点发挥作用。
既然ZYXIN在GBM细胞中能正向调控STMN1的转录，想知道是否STMN1过表达能在功能上回复ZYXIN敲低所致的GBM细胞迁移和侵袭的抑制。为此，在LN229/ctrl、LN229/shZYXIN#1、GBM1/ctrl和GBM1/shZYXIN#1中分别转入STMN1过表达病毒和对照病毒。对转染成功并经过流式细胞仪筛选的细胞进行transwell实验，结果表明，STMN1的过表达不仅能增加GBM细胞的迁移和侵袭能力，而且能明显回复ZYXIN敲低导致的迁移和侵袭的抑制作用。综上所述，我们的研究结果表明，在GBM细胞中，STMN1可能是ZYXIN发挥促侵袭作用的下游靶点。
在本研究中，可以得出以下结论：
（1）ZYXIN在GBM中显著增加，并且具有重要的预后价值，可用作一种新的肿瘤侵袭的生物标志物。
（2）ZYXIN是影响GBM细胞的体内、体外侵袭的重要分子，能促进GBM进展。
（3）ZYXIN通过调控STMN1的转录从而促进GBM细胞的迁移和侵袭。