红曲色素（Monascus pigments,MPs）是由红曲菌（Monascus spp.）产生的一类具有嗜氮酮结构的次级代谢产物,在我国及东南亚国家具有近两千年的应用历史。本课题组于2017年已经通过基因敲除等策略推导出较详细的MPs合成途径,即MPs基因簇中不同基因（MpigA、MpigC、MpigD、MpigE、MpigF、MpigG、MpigJ、MpigK、MpigM和MpigON）所表达的酶,依次参与合成与修饰,生成最终的MPs分子。然而,已解析的这条途径中所有产物都是嗜氮酮结构或其衍生物,并且部分基因并未见直接参与到MPs的合成中。已知结构的MPs分子上百种之多,且其结构也千差万别。其中,大部分MPs都具有一个嗜氮酮母环结构,而本课题组以及其他研究人员都发现了MPs基因簇还能够合成一系列与嗜氮酮色素在结构与功能上截然不同的萘醌分子（Naphthoquinones,NQs）。因此,我们推测在MPs基因簇中的一些基因,可能同时参与NQs和MPs的合成,两类化合物的形成过程是偶联合成的。为了证明上述猜想,本课题以NQs结构入手,推测了可能参与的基因,并采用米曲霉（Aspergills oryzae,AO）异源表达策略,将这些基因在AO M-2-3中组合表达,测定不同AO转化子的代谢产物种类与结构,从而研究NQs的合成途径,并解析其与MPs合成途径之间的偶联合成关系。1.MPs基因簇中不同基因组合在米曲霉M-2-3中异源表达转化子的构建基于本课题组前期对MPs合成途径的研究可知,MpigA编码的聚酮合酶是合成MPs的起始酶,MpigC等基因的产物是MPs合成的修饰酶。本课题根据NQs的分子结构与已知的MPs合成途径,推测MpigA（A）编码的聚酮合酶是合成NQs的起始酶,而MpigC（C）、MpigD（D）、MpigH（H）与MpigON（ON）这4个基因的产物可能是NQs合成过程中的修饰酶。以红曲菌M7的总m RNA逆转录的c DNA为模板,通过PCR技术获得上述5个基因片段,通过分子生物学手段构建不同基因组合的表达载体,并转化到AO M-2-3中,再经过筛选和验证,获得对应的AO转化子,名称分别为AO-A、AO-ON、AO-A-ON、AO-A-C、AO-A-D、AO-A-H和AO-A-C-D。其中,AO-A、AO-ON和AO-A-ON是本课题组前期已经构建的菌株。2.NQs抗生素与MPs偶联合成途径的发现与解析对“1”中获得的各AO异源表达转化子的米饭培养物中的代谢产物进行HPLC,可能的目标产物再进行LC-MS、纯化及NMR分析,从而确定各基因组合的产物结构。结果表明,转化子AO-A-C的产物物质1（苯甲醛的衍生物）,经其他酶修饰可形成MPs,而转化子AO-A-ON的产物物质2为萘酚结构,可进一步形成NQs。根据这2个转化子的基因组合方式以及对应产物物质1和2的分子结构的差异,我们推测认为,MpigA的产物一方面经MpigC催化生成MPs的前体物苯甲醛衍生物（物质1）,另一方面经MpigON催化生成NQs类抗生素的前体物萘酚物质（物质2）,两条途径偶联在一起并可能存在竞争性。而转化子AO-A-D、AO-A-H和AO-A-C-D在本实验条件下没有发现新的目标代谢产物。为构建含有MpigA、MpigC、MpigD和MpigON 4个基因的米曲霉转化子,我们进行了大量实验和尝试,但始终没有成功。为了验证上述4个基因是否能够催化合成MPs或其前体物质,将已构建的转化子AO-A-C-D和AO-ON进行了共培养,得到产物3。并通过液相色谱、光谱、氨反应以及文献报道,推断产物3可能是MPs中的一类非典型橙色素分子（Monasfluol A,Monasfluol B）。3.MPs聚酮合酶中串联ACPs的功能差异性前期分析发现MPs聚酮合酶MpigA中具有独特的串联ACPs结构域,因此本研究还对MpigA编码的MPs聚酮合酶中两个串联ACPs结构域（ACP1与ACP2）的功能进行了研究。通过定点突变的方法,构建两个ACP功能分别失活的MpigA表达载体,并获得相应的AO转化子AO-△ACP1和AO-△ACP2。对它们发酵产物分别进行分析,发现转化子AO-△ACP1不能合成转化子AO-A的对应产物,而转化子AO-△ACP2能够合成转化子AO-A的对应产物,但产物量浓度仅为AO-A的的10%左右。这一结果说明,ACP1可能控制聚酮合酶的活性,而ACP2只能影响聚酮合酶的合成效率。