研究背景:褪黑素（Mel）是主要由松果体分泌入血的一种内源性激素,具有镇静、催眠、调节血压、抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物学活性。近年来,多项基础和临床研究表明,褪黑素可有效缓解多种心血管疾病,且副作用小、经济、安全,是心血管防治领域极具开发前景的新药。充分证据显示,褪黑素心血管保护作用的发挥与其调节线粒体功能密切相关,但由于具体下游分子机制尚未完全阐明,成为限制其进一步临床推广和应用的瓶颈。SIRT3是主要分布于线粒体内的一种NAD⁺依赖的去乙酰化酶,可通过去乙酰化修饰多种线粒体蛋白,参与调节线粒体氧化应激、能量代谢、凋亡、线粒体生物发生等病理生理过程。更重要的是,越来越多的研究表明,SIRT3是心肌缺血再灌注（MIR）损伤、心梗、糖尿病心肌病（DCM）、化疗药物心脏毒性、心衰等多种心血管疾病的潜在干预靶点,是目前心血管保护研究领域的热点分子。然而,SIRT3是否介导褪黑素的心血管保护作用尚未见报道。另外,褪黑素在心血管疾病中如何调控SIRT3信号通路也需进一步阐明。研究目的:本研究旨在通过在体和离体实验探究褪黑素对于MIR损伤和2型糖尿病心肌病心肌重塑的保护作用,并阐明如下关键问题:1)SIRT3信号通路是否介导褪黑素抗MIR损伤作用;2)SIRT3信号通路是否介导褪黑素抗2型糖尿病心肌病心肌重塑作用;3)SIRT3介导褪黑素心血管保护作用的上下游分子信号通路。研究方法:1)MIR损伤小鼠模型的构建:通过短暂结扎（30 min）小鼠冠状动脉左前降支后恢复冠脉血流灌注法构建小鼠MIR损伤模型;再灌注前10 min,通过腹腔单次注射给予褪黑素（20 mg/kg）处理,再灌注3 h后检测蛋白表达变化、氧化应激指标;再灌注24 h后检测各组小鼠心脏功能、心梗面积以及心肌凋亡率。2)2型糖尿病（T2DM）小鼠模型的构建:通过高脂饮食（HFD）3个月后腹腔单次注射链脲佐菌素（STZ,100 mg/kg）构建T2DM小鼠模型。STZ注射5 d后检测各组小鼠3 h空腹血糖,血糖值≥13.88 mmol/L认为T2DM建模成功。血糖达标的小鼠继续HFD并通过饮水摄入褪黑素（20 mg/kg/day）,给药时间为4个月。3)超声心动图检测:使用Vevo 2100小动物超声影像系统检测并计算小鼠左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。4)血流动力学检测:通过Millar导管检测各组小鼠心脏血流动力学改变。检测指标包括左心室舒张末压（LVEDP）、左心室收缩压最大上升速率（+dP/dt）和左心室舒张压最大下降速率（-dP/dt）。5)缺血再灌注后心梗面积和血清乳酸脱氢酶（LDH）活性测定:通过TTC/Evans蓝染色检测各组小鼠心梗面积,其中蓝染区域为非缺血区,红染区域为缺血非梗死区,白染区域为梗死区。梗死面积以梗死区/缺血区×100%表示。此外,通过LDH活性检测试剂盒检测各组小鼠血清内LDH活性。6)氧化应激指标检测:通过DHE染色检测心脏组织活性氧（ROS）产量;分别通过DCFH-DA染色和Mito-Tracker/Mito-SOX双染色技术检测H9c2细胞和原代成纤维细胞内ROS产量;通过试剂盒检测丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性;通过Western blotting技术检测NADPH氧化酶2（NOX2）、红系衍生的核因子2相关因子（Nrf2）和醌NADH脱氢酶1（NQO1）的表达量。7)凋亡相关指标检测:通过TUNEL/DAPI染色检测凋亡情况,凋亡率以TUNEL阳性细胞核/总细胞核×100%表示。此外,通过Western blotting技术检测凋亡通路主要标志分子B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、线粒体内Bax（Mito-Bax）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）以及细胞质内细胞色素C（Cyt-Cyto C）的蛋白表达情况。8)炎症反应相关指标检测:通过CD68（巨噬细胞标志分子）免疫荧光染色检测心脏内巨噬细胞浸润情况;通过Western blotting技术检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）的蛋白表达情况。9)心肌肥厚相关指标检测:通过测量心脏重量和胫骨长度,计算心脏胫骨比（HW/TL）;通过HE染色检测左心室心肌细胞平均横截面积。10)心肌纤维化相关指标检测:通过Masson和天狼星红染色检测心脏血管周围和心肌间质内胶原沉积情况;通过I型胶原蛋白（Collagen I）和III型胶原蛋白（Collagen III）免疫组化染色检测心肌组织胶原蛋白表达水平;通过Westernblotting技术检测转移生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、p-Smad3和Smad3的蛋白表达量。11)细胞活力检测:通过CCK-8试剂盒检测H9c2细胞和成纤维细胞的细胞活力。12)成纤维细胞向肌成纤维细胞转化指标检测:通过细胞免疫荧光染色和Westernblotting技术检测成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平,评估成纤维细胞向肌成纤维细胞转化情况。研究结果:1)褪黑素有效缓解了小鼠MIR损伤。与Sham组相比,IR+V组小鼠LVEF和LVFS明显降低,心梗面积和血清内LDH活性明显增高。与IR+V组相比,褪黑素可明显提高MIR后LVEF和LVFS,减少心梗面积,降低血清内LDH活性。此外,与Sham组相比,IR+V组小鼠心肌组织SIRT3的表达和活性均明显降低,而SOD2的乙酰化水平明显增加。与IR+V组相比,褪黑素明显上调SIRT3的表达和活性,降低SOD2的乙酰化水平。2)褪黑素减轻了小鼠MIR引发的心肌氧化应激损伤和凋亡。与Sham组相比,IR+V组小鼠心肌组织内gp91^{pho x}表达量和MDA含量显著增加,而SOD活性、GSH-Px活性、Nrf2和NQO1表达量显著降低,提示MIR后心肌发生氧化应激损伤。此外,与Sham组相比,IR+V组小鼠心肌凋亡率、Cyt-Cyto C、总Bax、Mito-Bax、Caspase-3以及cleaved Caspase-3的表达量明显升高,而Bcl-2表达量明显降低,提示MIR后心肌凋亡途径激活。褪黑素能明显逆转上述改变,即褪黑素能够抑制MIR引起的氧化应激损伤和心肌凋亡。3)SIRT3/SOD2信号通路介导褪黑素抗小鼠MIR损伤保护作用。首先,与IR+Mel组相比,IR+Mel+3-TYP（SIRT3抑制剂）组小鼠LVEF和LVFS明显降低,而心梗面积和血清LDH活性明显增加。其次,与IR+Mel组相比,IR+Mel+3-TYP组小鼠心肌组织中gp91^{pho x}表达量和MDA含量明显增加,而SOD活性、GSH-Px活性和NQO1表达量明显降低。此外,与IR+Mel组相比,IR+Mel+3-TYP组小鼠心肌凋亡率、Cyt-Cyto C、总Bax、Mito-Bax、Caspase-3以及cleaved Caspase-3的表达量明显增加,而Bcl-2的表达量明显降低。4)褪黑素通过激活SIRT3/SOD2信号通路抑制H9c2细胞缺血再灌注损伤。为了明确褪黑素是否直接作用于心肌细胞且进一步阐明褪黑素抗MIR损伤的具体分子机制,我们将H9c2心肌细胞用缺血液处理1 h后再用无血清DMEM处理4 h模拟缺血再灌注（SIR）损伤。结果显示,SIR后H9c2细胞的细胞活力明显降低。褪黑素（50、100、200μM）对于正常H9c2细胞的细胞活力无明显影响,然而褪黑素可呈剂量依赖性地提高SIR后H9c2细胞的细胞活力,且剂量为100μM时保护作用最佳。与SIR组相比,褪黑素处理明显抑制SIR引起的氧化应激损伤和H9c2细胞凋亡。与在体结果相一致的是,褪黑素明显激活SIR处理后H9c2心肌细胞内SIRT3/SOD2信号通路。通过SIRT3 siRNA抑制SIRT3的表达后,褪黑素的上述心肌保护作用明显削弱。5)褪黑素以沉默信息调控因子1（SIRT1）依赖性的方式激活MIR后心肌组织SIRT3/SOD2信号通路。值得注意的是,MIR后心肌组织内SIRT1和SIRT3的表达量均明显降低,而褪黑素可同时上调SIRT1和SIRT3的表达。EX527或SIRT1siRNA抑制SIRT1信号后,SIRT3的表达和活性也明显降低;而3-TYP或SIRT3siRNA抑制SIRT3信号后,SIRT1的表达和活性无明显变化。以上结果提示,MIR损伤时SIRT1是SIRT3的上游信号分子。6)T2DM小鼠心肌组织内AMPK-SIRT3信号通路明显受损,而褪黑素可激活AMPK-SIRT3信号通路。为明确AMPK-SIRT3信号通路在褪黑素抗糖尿病心肌病心肌重塑中的具体作用,我们采用Compound C（CC）和3-TYP分别选择性地抑制AMPK和SIRT3。Compound C处理可明显抑制AMPK磷酸化,降低SIRT3的表达和活性;而3-TYP或SIRT3 siRNA仅能抑制SIRT3信号,对于AMPK的磷酸化无明显影响,提示AMPK是SIRT3的上游信号。7)褪黑素通过激活AMPK-SIRT3信号通路抑制T2DM引起的心肌肥厚以及心脏收缩舒张功能障碍。与Control组相比,DM组小鼠HW/TL、左心室心肌细胞平均横截面积和LVEDP明显增加,LVEF、LVFS、+dP/dt和-dP/dt明显降低;褪黑素可明显逆转上述改变。而抑制AMPK-SIRT3信号通路后,褪黑素的上述抗心肌肥厚和改善心脏功能作用明显减弱。8)褪黑素通过激活AMPK-SIRT3信号通路抑制T2DM引起的心肌纤维化。与Control组相比,DM组小鼠心脏血管周围和心肌间质内胶原沉积量、Collagen I、Collagen III、TGF-β1、CTGF和α-SMA的表达量以及Smad3的磷酸化水平明显增加;褪黑素可明显逆转上述改变。而抑制AMPK-SIRT3信号通路后,褪黑素的上述抗纤维化作用明显减弱。9)褪黑素通过激活AMPK-SIRT3信号通路抑制T2DM引起的心肌炎症反应和氧化应激损伤。与Control组相比,DM组小鼠心脏TNF-α、IL-6和IL-1β表达量以及巨噬细胞浸润明显增加。此外,与Control组相比,DM组小鼠心脏ROS产量、MDA含量和NOX2表达量明显增加,而SOD活性和GSH-Px活性明显降低。褪黑素可明显逆转上述改变。而抑制AMPK-SIRT3信号通路后,褪黑素的上述抗炎和抗氧化作用明显减弱。10)褪黑素通过激活AMPK-SIRT3信号通路抑制高糖诱导的成纤维细胞增殖、成纤维细胞向肌成纤维细胞转化以及合成分泌纤维化相关蛋白。与NG组相比,HG组成纤维细胞内AMPK-SIRT3信号明显受损,而褪黑素可激活高糖处理后成纤维细胞AMPK-SIRT3信号通路。此外,NG组相比,HG组成纤维细胞的细胞活力、Collagen I、Collagen III、TGF-β1、CTGF和α-SMA的表达量以及Smad3的磷酸化水平明显增加,而褪黑素可以减轻高糖诱导的上述改变。Compound C和SIRT3 siRNA分别选择性地抑制AMPK和SIRT3后,褪黑素的上述抗纤维化作用明显减弱。11)褪黑素通过激活AMPK-SIRT3信号通路抑制高糖诱导的成纤维细胞氧化应激水平。与NG组相比,HG组成纤维细胞ROS产量、MDA含量和NOX2表达量明显增加,而SOD活性和GSH-Px活性明显降低。褪黑素可以减轻高糖处理后成纤维细胞氧化应激水平,但抑制AMPK-SIRT3信号通路后,褪黑素的抗氧化作用明显减弱。研究结论:1)我们首先证实褪黑素可通过激活SIRT3信号通路抑制心肌线粒体氧化应激损伤和凋亡途径的激活,进而缓解MIR损伤,且褪黑素以SIRT1依赖性的方式激活MIR后心肌组织SIRT3信号通路;2)我们首先证实褪黑素可通过激活SIRT3信号通路抑制心脏氧化应激水平和炎症反应,进而缓解2型糖尿病心肌病心肌重塑,且褪黑素主要以AMPK依赖性的方式激活2型糖尿病心脏组织SIRT3信号通路;此外,褪黑素可通过激活AMPK-SIRT3信号通路,降低成纤维细胞氧化应激水平,抑制高糖诱导的心脏成纤维细胞增殖以及成纤维细胞向肌成纤维细胞转化;3)本研究利用两种常见心血管疾病小鼠模型,通过在体和离体实验,证实褪黑素是缓解MIR损伤和2型糖尿病心肌重塑的有效策略并详细阐明了其下游分子机制,为褪黑素的进一步临床推广与应用提供了新的理论基础。