基于壳聚糖微球的短乳杆菌固定化技术研究

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葡萄糖异构化是果糖生产中极为关键的一步,葡萄糖异构酶是葡萄糖异构化工艺中的关键酶。短乳杆菌是一种能产生胞内葡萄糖异构酶的微生物,本试验首先对短乳杆菌产葡萄糖异构酶培养基进行优化,以提高短乳杆菌的产酶能力,再用壳聚糖微球对短乳杆菌进行固定化,对固定化细胞的性质及其动力学进行了初步研究,并用固定化细胞进行了分批转化试验,为固定化细胞催化反应器的设计及操作条件的确定提供了良好的理论依据。通过试验,初步得到以下结论:(1)在MRS培养基的基础上,采用响应面分析法对短乳杆菌葡萄糖异构酶发酵培养基进行优化,首先通过Plackett-Burman法确定出MgSO4·7H2O、玉米浆干粉和木糖为主要影响因子,然后设计旋转中心组合试验进行响应面分析,确定了最佳产酶培养基:木糖13.43 g/L、玉米浆干粉23.14g/L、MgSO4·7H2O 2.54g/L,MnSO4·4H2O 0.25 g/L,酵母膏5 g/L,醋酸钠5g/L,柠檬酸三铵2g/L ,K2HPO4 2 g/L,Tween-80 1mL/L,pH 6.2-6.4。经培养发酵后,葡萄糖异构酶产量达到80.5U,比优化前提高了33.06%。(2)制备壳聚糖微球,用壳聚糖微球采用先吸附后交联的方法对短乳杆菌细胞进行固定化。研究表明:固定化细胞的活力受载体与酶的比例、交联剂的用量、吸附时间,吸附温度,交联时间,交联温度等因素的影响。利用中心旋转组合试验,确定了最佳的固定化条件:最佳给酶量为81.3mg/g载体,吸附温度为10℃,最佳吸附时间为3h,戊二醛浓度为0.75%,最佳交联时间为3h,交联温度为4℃,此条件下固定化短乳杆菌葡萄糖异构酶酶活为29.79U,固定化细胞的酶活回收率为80.37%。(3)研究了固定化细胞的性质。确定固定化细胞的最适温度是80℃,且固定化细胞在80℃以下均稳定,较游离细胞的热稳定性有了较大的提高;固定化细胞的pH最适范围在8.0左右,较游离细胞的pH最适范围有所提高,并且固定化细胞在pH7.0-9.0之间最稳定;不同的金属离子对原酶活力有不同的影响,Mg2+和Co2+对固定化细胞具有一定激活作用,且Mg2+与Co2+相比,前者的作用更为显著,而Fe2+,Mn2+对固定化细胞有一定的抑制作用;得到了固定化细胞的Km和Vmax,Km=141.39mg/mL, Vmax=0.284mg/mL·min;反应体系中不存在高浓度底物抑制的现象,存在产物抑制现象。(4)利用固定化细胞进行了分批转化试验,研究了最适温度,最适pH,以及金属离子对分批转化试验的影响。pH控制在7.0-8.0之间较好,转化温度控制在60℃-80℃,添加Mg2+和Co2+有利于提高转化效率。
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