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第一部分TBL1XR1在胰腺导管腺癌中异常表达及其临床意义目的研究转导蛋白β样1X相关蛋白1(TBL1XR1)在胰腺导管腺癌中的表达情况及其与胰腺导管腺癌患者临床病理特征间的关系。方法收集苏州大学附属常熟市第一人民医院收治的46例胰腺导管腺癌肿瘤组织及其配对的癌旁组织样本,采用免疫组织化学(IHC)染色方法、蛋白质免疫印迹(Western Blot)和实时荧光定量PCR检测TBL1XR1表达水平,并结合患者临床病理资料分析相关关系。本研究获得本院伦理委员会批准,且所有患者均被提前告知并签署知情同意书。结果46例胰腺导管腺癌患者手术获取肿瘤组织和癌旁组织检测分析TBL1XR1在mRNA转录水平和蛋白质翻译水平上相对高表达,差异有统计学意义(p<0.05)。46例患者中年龄超过60岁者为27例,其中TBL1XRl阳性68.4%,年龄低于60岁者19例,其中TBL1XR1阳性66.7%,p>0.05,无统计学意义。男性患者23例,其中TBL1XR1阳性65.2%,而女性患者为23例,其中TBL1XR1阳性69.6%,p>0.05,无统计学意义。胰腺导管腺癌病灶特征上,肿瘤直径≥3 cm的患者人数为12例,其中TBLlXR1阳性50.0%,肿瘤直径<3 cm的患者人数为34例,其中TBL1XR1阳性73.5%,p>0.05,无统计学意义。肿瘤TNM分期中,Ⅰ-Ⅱ期的患者为8例,其中TBL1XR1 阳性 25.0%,Ⅲ期患者为 38 例,其中 TBL1XR1 阳性 76.3%,p<0.01,有统计学意义。局部淋巴结转移的情况,46例患者中有淋巴结转移的患者为19例,其中TBL1XR1 阳性73.7%,无淋巴结转移27例,其中TBL1XR1阳性63.0%,p>0.05,无统计学意义。总之,PDAC中TBLlXR1的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤组织的分化程度,肿瘤大小(最大直径)和部位,淋巴结转移情况都无明显相关关系(p>0.05)。而却与肿瘤恶性程度、TNM分期密切相关(p<0.01),具有统计学意义。PDAC患者肿瘤恶性程度高,其TBL1XR1表达量显著高于低恶性程度PDAC患者(75.6%vs 33.3%)。结论1、TBL1XR1在胰腺导管腺癌组织中高水平表达。2、TBL1XR1与PDAC肿瘤恶性程度(TNM分期)密切相关。3、高表达TBL1XR1提示患者预后不佳,生存率低,提示TBL1XR1基因在胰腺癌进展过程中可能起到重要作用。第二部分TBL1XR1调控胰腺癌肿瘤细胞体外增殖凋亡和体内成瘤能力的研究目的研究TBL1XR1对胰腺癌肿瘤细胞体外增殖凋亡和体内成瘤能力的调控作用。方法利用RNA干扰技术调控降低了基础水平表达较高的胰腺癌细胞系中TBLXR1蛋白的表达量,转染48-72小时后采用qRT-PCR和Western Blot试验验证干扰沉默效率;以体外细胞增殖实验、克隆形成试验、细胞周期试验、细胞凋亡试验以及裸鼠体内成瘤实验观察通过抑制TBL1XR1表达对人胰腺癌细胞体内外增殖成瘤能力及细胞周期凋亡的影响。利用细胞质粒DNA转染表达低细胞株,研究对细胞功能的影响。结果TBL1XR1在胰腺癌细胞系中的表达水平各有差异,其中在Aspc-1和Pancl细胞系中相对高水平表达。对这两株细胞系利用RNAi技术获得高水平沉默TBL1XR1的效率。TBL1XR1促进胰腺癌细胞体外增殖及克隆形成。TBL1XR1影响胰腺癌细胞周期进程,促进细胞向G2/M期转化。TBL1XR1抑制胰腺癌细胞凋亡。TBL1XR1促进胰腺癌细胞裸鼠皮下体内成瘤及增殖。被转染DNA细胞株表达外源性TBL1XR1明显增高。结论TBL1XR1可以在体外促进胰腺癌细胞增殖能力及克隆形成能力;TBL1XR1可能通过减少胰腺癌细胞株G0/1期阻滞和抑制细胞凋亡促进细胞生存;TBL1XR1在胰腺癌细胞体内成瘤增殖中发挥重要作用。第三部分TBL1XR1通过激活PI3K信号通路促进胰腺导管腺癌发生发展目的研究TBL1XR1对胰腺癌细胞增殖、周期凋亡等相关信号通路的影响。方法运用Western Blot实验验证胰腺癌细胞经RNAi干扰TBL1XR1表达后细胞周期相关蛋白表达量改变情况,细胞凋亡相关蛋白表达情况,以及PI3K、AKT和ERK1/2信号通路的蛋白磷酸化水平改变情况。使用PI3K通路抑制剂LY294002观察能否回复胰腺癌细胞的增殖作用。结果TBLIXR1表达量降低后,Cyclin A和CDK2细胞周期蛋白表达量随之下降,Cyclin D周期蛋白表达量升高,同时csc25a周期蛋白的表达量也明显下降。TBL1XR1蛋白水平不足导致了胰腺癌细胞在G0/1期发生滞留,细胞无法顺利从G0/1期过度到S期及后续G2/M期的分裂进程。TBL1XR1表达量下降后,Bax表达量增多,Bcl-2下降,Bax/Bcl-2比值升高,代表细胞凋亡的促进。另外,降低TBL1XR1蛋白表达水平后,磷酸化形式的P13K表达下降,磷酸化形式的Akt表达也同时下降,代表该PI3K/Akt通路信号转导的活性下降,即其促进胰腺癌细胞增殖的能力减弱。PI3K通路抑制剂LY294002能够有效回复TBL1XR1促胰腺癌细胞增殖功能的作用。结论TBL1XR1表达降低后细胞内周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化与胰腺癌细胞表型结果相符。TBL1XR1通过激活胰腺癌细胞内PI3K/Akt信号转导通路发挥促进胰腺癌细胞增殖的作用。PI3K/Akt通路是TBL1XR1发挥其生物学功能的主要下游通路,PI3K抑制剂LY294002可以有效回复TBL1XR1促进胰腺癌细胞增殖进展的效果。