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DNA磷硫酰化修饰，是指DNA骨架上非磷氧桥上的一个氧被硫取代的一种DNA修饰现象。DNA发生磷硫酰化修饰后，在电泳过程中易被降解（DNA degradation），故定义为Dnd表型，现已证明该修饰在细菌中广泛存在，且在科属间有明显的修饰水平差异。DNA磷硫酰化修饰是机体的一种抗氧化机制、可被IV型限制性内切酶ScoMcrA切割、与宿主专一性限制修饰系统相关。该修饰受一组被命名为dnd的基因簇控制，包括5个基因，定名为dndABCDE；而后随着DNA磷硫酰化修饰现象在更多细菌中的报道，发现60％以上具有磷硫酰化修饰的细菌，其dnd簇并未囊括到修饰所必需的半胱氨酸脱硫酶基因dndA，Salmonella enterica serovar Cerro87就是其中的一例，其dnd簇被命名为dptBCDE。 E.coli DH10B以其研究背景清晰、容易操作而被分子生物学研究者所选用，为深入研究细菌 DNA磷硫酰化修饰的发生机制及各基因的功能，本研究前期工作将S.enterica的dptBCDE转化E.coli DH10B，发现后者获得了Dnd表型。于是我们推断E.coli中有dndA的同源基因发挥了dndA的半胱氨酸脱硫酶基因功能，而E.coli中dndA的同源基因有sufS、csdA和iscS三种，所以本研究从确认E.coli中可替代dndA功能的同源基因入手。因E.coli BW25113已有可供利用的资源库，为研究方便，我们首先确认E.coli BW25113和E.coli DH10B一样，自身并不具备DNA磷硫酰化修饰特性，而在转化S.enteric dptBCDE后获得了Dnd表型。由此确认本研究以E.coli BW25113作为后续研究的基本宿主菌。本研究取得如下成果： 采用PCR-targeting技术，成功构建了E.coli BW25113脱硫酶基因iscS的缺失突变株AXH034（E.coli BW25113△iscS），并对该菌种的特性和生长情况进行了研究。结果显示，该突变株生长明显弱于野生菌株，生长速度减半，接种后3h进入对数期、16h进入稳定期，而野生株或用iscS回补的菌株进入对数期和稳定期分别只需要1.5h和8h。 将S.enterrica dptBCDE转化E.coli BW25113及其衍生株E.coli BW25113△iscS、E.coli BW25113△sufS和E.coli BW25113△csdA，分别鉴定宿主菌的Dnd表型，结果显示只有宿主E.coli BW25113△iscS失去了Dnd表型；再将E.coli iscS克隆，与S.enterrica dptBCDE共转化E.coli BW25113△iscS，使宿主的Dnd表型得以回复。证明E.coli中IscS参与DNA磷硫酰化修饰并行使DndA的功能。 将E.coli IscS的三个半胱氨酸定点突变为丙氨酸，然后分别用含突变碱基的质粒与S.enterrica dptBCDE共转化E.coli BW25113△iscS，结果显示只有C328被突变后不能回复宿主的Dnd表型，故确认C328是IscS参与DNA磷硫酰化修饰的活性位点。 文献报道，E.coli IscS参与铁硫簇的组装、tRNA的硫修饰、硫胺素和钼铁林辅助因子的生物合成等多条代谢途径，其直接受体包括IscU、ThiI、TusA和MoaD等，相关蛋白有IscA、IscX、ThiS、ThiF、Cya和MoeB等。为探知IscS参与DNA磷硫酰化修饰过程的受体蛋白或相关蛋白，我们将S.enterrica dptBCDE转化上述受体蛋白和相关蛋白的缺失突变株，检测各宿主的Dnd表型，结果显示上述基因的突变，均不影响S.enterrica dptBCDE赋予宿主的Dnd表型，说明E.coli IscS参与DNA磷硫酰化修饰的受体蛋白有别于其它硫传递途径。 细菌双杂交实验和Pull Down实验均证明IscS与S.enterrica DptC和DptE有相互作用，说明IscS的受体蛋白很可能是DptC或DptE。进一步将S. enterrica DptC中的六个半胱氨酸进行定点突变，检测被突变的质粒转化E. coli BW25113后对后者Dnd表型的影响。结果表明，DptC中C146、C262、C273、C280和C283位点的五个Cys与宿主的磷硫酰化修饰有关；结合S.lividans DndC为[4Fe-4S]蛋白的报道，推断 DptC也是一铁硫簇蛋白，前述五个半胱氨酸，其中一个直接参与磷硫酰化修饰，另外四个参与[4Fe-4S]铁硫簇的组装。而DptE中无半胱氨酸的存在，只能协助硫的传递。故本研究认为DptC很可能是E.coli IscS参与DNA磷硫酰化修饰的受体蛋白，而DptE是一伴侣分子或双链切口结合蛋白。 为进一步分离纯化各蛋白，进而研究其酶学功能，本研究通过常规基因克隆技术构建了E.coli iscS和S.enterica dpt基因的表达载体，优化了各蛋白的表达条件：IscS：20-30℃，10-12h，IPTG0.2mM；DptB：25-30℃，4-12h，IPTG0.2mM；DptC：18℃，8-18h，IPTG0.6mM，添加50μM Fe2+；DptD：25-30℃，8h，IPTG0.4mM，高产但可溶性差；DptE：18℃或更低，8-18，IPTG0.2mM。