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目的：
人类致病性变异链球菌是一类定植于口腔的革兰阳性球菌,是龋齿的主要致病菌,同时也是感染性心内膜炎的主要病因。磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶(GART)催化嘌呤从头合成的第一次依赖叶酸的转甲酰基反应,即催化GAR和10-甲酰四氢叶酸反应,生成甲酰甘氨酰胺核苷酸和四氢叶酸酯。由于嘌呤核苷酸与多种细胞过程密切相关,该酶也成为多种抗瘤剂特别是肿瘤化疗药物的作用靶点。迄今为止变异链球菌属GART的结构尚未解析,我们希望通过解析变异链球菌GART的三维结构,为变异链球菌致龋的发病机制及抗变异链球菌药物的开发提供理论基础。
方法：
1)重组质粒的构建及鉴定根据GenBank中Streptococcus mutans UA159株的基因组序列,设计PCR引物,扩增GART的编码DNA序列,将其克隆至pET-28a(+)载体中,构建与His标签融合的重组质粒。
2)GART的诱导表达与纯化将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和质谱分析表达的目标蛋白。然后用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤纯化目标蛋白。
3)GART的结晶与结构解析使用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒对纯化好的蛋白进行晶体生长条件筛选,对初筛生长条件进行优化以期得到适于X光衍射的单晶,通过同步辐射加速器收集晶体衍射数据,借助于CCP4等一系列蛋白结构解析软件进行结构解析。
结果：
1)GART在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经质谱鉴定及SDS-PAGE分析,证明所表达的蛋白为变异链球菌的GART。
2)通过对GART表达及纯化条件的优化,确立了GART母体蛋白及其硒代衍生物蛋白的纯化方法,经SDS-PAGE分析,最终得到纯度高达98％的GART母体蛋白及其硒代衍生物蛋白。
3)使用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒对晶体生长条件进行筛选,得到了GART母体蛋白及其硒代衍生物蛋白晶体的生长条件并对其进行了优化,得到适于衍射数据收集的晶体。
4)在上海同步辐射光源收集衍射数据,GART母体蛋白晶体衍射达到2.1(A),硒代衍生物蛋白晶体衍射达到2.0(A),用分子置换法和MAD法成功解析了GART的结构,并对结构与功能的关系进行了分析。
结论：
成功地在大肠杆菌中高效表达了变异链球菌GART蛋白,建立了完善的纯化工艺,并成功解析了GART的结构。