“跨界基因沉默”技术是一种全新概念的小分子干扰RNA传递技术,其主要方法是利用基因被人为改造的、能侵入哺乳动物细胞的细菌合成小分子干扰RNA,这种携带有可沉默特定基因的小分子RNA的细菌在缺氧环境或者目标细胞表面受体的协助下侵入细胞,细菌在胞浆中被裂解后可以将其携带的小分子干扰RNA释放出来,从而诱发特异性基因沉默。“跨界基因沉默”技术能基本解决了 RNA干扰物的稳定性、靶向性和传递速率的问题。要利用“跨界基因沉默”技术来治疗艾滋病,首先得构建针对T淋巴细胞的“跨界基因沉默”菌株。本研究将对“跨界基因沉默”质粒Trip(Trans-kingdom RNA interfering plasmid)进行改造,改造从两方面入手:第一方面,因为艾滋病毒具有极高的突变与变异,为了避免由此导致的干扰失败,除了选择保守性较强的区域作为攻击靶点外,我们可以考虑扩展攻击范围。由于可以利用细菌内存在丰富的RNA酶Ⅲ,从而将长片段双链RNA干扰物剪切成短片段混合物而发挥基因沉默的功能。如此,由于能攻击更宽范围的靶标序列,即便出现少数的突变也不至于造成干扰完全失败,因而在对付突变及变异频率都较高的艾滋病毒上会有一定的优势。故我们对TRIP质粒进行了改建,使其通过T7启动子表达长片段双链RNA而非短发夹干扰RNA。另一方面是要降低其生物毒性,因而构建了减毒型“跨界基因沉默”质粒,最后运用Red/ET同源重组技术将减毒型特异性Trip质粒整合入大肠杆菌BL21(DE3)基因组中,把大肠杆菌BL21(DE3)改造成针对艾滋病毒的“跨界基因沉默”菌株。在构建好该沉默菌株后让其干扰SW480细胞中HIV关键基因nef的表达,通过Western Blot蛋白检测技术检测细菌干扰细胞蛋白的表达情况。