Nupr1在甲基苯丙胺所致肝脏毒性损伤中的作用研究

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研究背景:甲基苯丙胺(Mehamphetamine,METH),中文名又称为甲基安非他明、去氧麻黄,因其为纯白色晶体,外观晶莹剔透,成瘾性强,故又称之为“冰毒”。由于其生产原料易于获取,加工工艺较为简单,用药后起效时间短,作用时间长,使用后给人带来较为强烈的兴奋体验,其滥用在全世界范围内迅速蔓延。近些年来,虽经我国政府严格管控,但由于METH相对大麻等其他毒品售价低廉,兴奋性及成瘾性强,故METH的滥用呈愈演愈烈的趋势,不仅滥用率和滥用范围不断增长扩大,其滥用人群的年龄结构也有低龄化趋势。甲基苯丙胺的滥用不仅给滥用者本人带来了精神上的损害、社会治理和管控的挑战,而且还带来了身体上的损害,导致脑、心、肝、肾等器官和组织的毒性损伤,劳动能力下降,早老早衰等,增加了负担。在法医学实践中,也常常会遇见滥用者因吸食过量致其猝死的检案。近些年来,对于METH研究多集中于中枢神经系统,对中枢神经系统以外造成损伤的研究较为少见。我们课题组前期研究结果表明,METH有明确的神经系统毒性及心血管毒性,可以造成较为严重的神经细胞的损伤及心血管内皮的损伤。肝脏作为METH的主要代谢器官,更容易受到METH导致的损伤,但损伤机制也一直并不清楚。本研究初步METH对肝脏毒性损伤的作用及其机制。转录调节因子核蛋白(nuclear protein,Nupr1)是一种重要的细胞胁迫蛋白,在细胞面对各种不同环境和复杂应激下发挥了重要的作用,我们教研室在前期的研究中发现,在相对较高给药量的前提下,Nupr1可以通过Chop介导的自噬在甲基苯丙胺的毒性作用中发挥着十分重要的作用(Nupr1通过Chop介导内质网应激同路参与METH诱导的神经自噬),然而其在甲基苯丙胺引起的肝脏毒性中所起的作用未见报导。本课题拟建立甲基苯丙胺亚急性中毒野生型组和Nupr1敲基因组模型,通检测自噬相关蛋白BECLIN1、LC3Ⅱ、ATG5表达量,探讨Nupr1敲除对甲基苯丙胺中毒和自噬的影响,随后对两组进行形态学的观察和比较以及对Chop表达水平的检测,我们初步探讨了 Nupr1在较大剂量甲基苯丙胺中毒时的作用和相关分子机制并为甲基苯丙胺引起的肝损伤毒性的作用机理提供理论依据。研究目的分别建立甲基苯丙胺中毒的C57野生型小鼠模型和Nupr1敲基因鼠模型,通过Rt-qPCR及Western Blot分别检测自噬相关蛋白表达水平,从分子水平检测给药后肝脏损伤变化特点,随后进行HE染色检查,从形态学角度观察给药后肝脏损伤变化特点;最后检测Chop表达水平的变化,探讨其中分子机制。从形态学及分子水平验证Nupr1敲除对甲基苯丙胺中毒所致肝损伤的影响并探讨相关分子机制,从而为相对较高剂量甲基苯丙胺所造成的肝脏毒性提供更多的理论依据。实验方法1.将所有老鼠分为四组:对照组(野生C57小鼠);给药组(野生C57小鼠+METH);Nupr1敲基因实验组(Nupr1敲基因小鼠+METH);Nupr1敲基因对照组(Nupr1敲基因小鼠)。2.METH野生型C57小鼠亚急性中毒模型组(给药组模型)建立:按照科室已有模型建立METH中毒模型:METH亚急性中毒模型:给药量:15mg/kg,每隔12h打一针,合计8针。.METH Nupr1敲基因C57小鼠亚急性中毒模型组(Nupr1敲基因实验组)建立,按照科室已有模型建立METH中毒模型:METH亚急性中毒模型:给药量:15mg/kg,每隔12h打一针,合计8针。对照组及Nupr1敲基因对照组分别注射等量的生理盐水。3.最后一针给药后12h,将小鼠使用戊苯巴比妥麻醉,随后将小鼠进行心脏灌流,尽可能排净肝脏组织中的血液,提取的老鼠肝脏组织每只分成三份备检。4.将其中一份提取的肝脏组织固定,脱水,包埋,切片,染色,封片,做HE染色。5.将其中一份肝脏组织(大于100mg)做Rt-qPCR检测。6.将剩余肝脏组织提取20mg左右,液氮冷冻,放入组织研磨仪中研磨,RIPA裂解液冰上裂解,超声裂解,0-4℃高速离心,取上清,提蛋白,做western blot检测。实验结果:1.METH引起小鼠肝脏损伤及自噬水平提高,2.给药组C57小鼠中自噬相关蛋白ATG5、LC3 Ⅱ、BECLIN1经Western-blot检测较Nupr1敲基因实验组高表达。3.METH给药组C57小鼠中自噬相关基因Lc3B、Beclin1相对表达量经RT-qPCR检测较METH给药Nupr1敲基因实验组高表达。4.HE染色结果显示METH给药Nupr1敲基因组肝损伤轻于野生给药组5..使用Rt-qPCR和Western blot检测各组Chop(DDIT3)表达量差异 给药组较对照组高表达,给药组较Nupr1敲基因实验组高表达。6.使用Western blot检测mTOR及p-mTOR表达量水平变化,给药组较Nupr1敲基因实验组低表达实验结论:1.甲基苯丙胺造成肝脏毒性并增加了自噬相关表达2.Nupr1敲除降低了甲基苯丙胺处理后肝脏的高表达的自噬水平3.Nupr1敲除缓解了甲基苯病胺所致的肝脏损伤。4.Nupr1敲除通过抑制Chop介导的内质网应激自噬减轻甲基苯丙胺的对肝脏的毒性作用。
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