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背景和目的子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全球范围内宫颈癌发病率在女性癌症中占第三,仅次于肺癌和胃癌,约有90%的宫颈癌死亡病例发生在发展中国,严重威胁着女性生命健康。宫颈癌最主要的两种类型是鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,ADCA),宫颈鳞癌约占80%左右,近年来宫颈腺癌的发病率不断增加。持续的高危型人乳头瘤病毒(high risk human papilloma virus,HR-HPV)感染是宫颈癌最主要的致癌因子,其中HPV16和HPV18是最常见的HR-HPV型别。早期蛋白E6和E7是HR-HPV的主要癌蛋白,E6可泛素化水解P53,导致P53依赖的细胞凋亡和/或衰老的损失,而E7结合p RB从而导致细胞周期紊乱。因此,HR-HPV感染可导致细胞的恶性转化和肿瘤的发展。1993年Charles等在小鼠成纤维细胞中发现了即刻早期反应基因(Immediate early response gene X-1,IEX-1),作为即刻早期基因(immediate early gene,IEG)一员,IEX-1可以在多种刺激条件下短暂快速地表达。这些刺激因子包括生长因子、细胞因子、电离辐射、病毒感染和其他类型的细胞应激因素。IEX-1参与细胞的代谢、增殖、凋亡、分化及细胞周期调节等多种生物学效应。IEX-1在调节细胞周期和凋亡过程中发挥着复杂的作用。虽然目前研究已经证实在多种人类恶性肿瘤中IEX-1表达失调,但在宫颈癌中IEX-1的研究较少,IEX-1在宫颈癌中的表达情况如何,IEX-1表达与宫颈HPV感染是否相关尚不清楚。本研究将通过免疫组化法分析IEX-1在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)组织及正常宫颈组织中的表达情况,分析IEX-1的表达与宫颈癌临床病理关系,预测IEX-1在宫颈癌发生发展中的作用。并通过实时荧光定量PRC(RT-q PCR)法及Western Blot法分析不同HPV感染状态的宫颈癌细胞中IEX-1的表达差异。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象。RNAi法具有高度的序列专一性,通过瞬时转染si RNA导入细胞可以特异地使特定基因沉默。我们通过设计针对HPV16 E6的si RNA,转染Si Ha细胞,特异性沉默Si Ha细胞中E6的表达,检测沉默E6前后Si Ha细胞中IEX-1的表达,以探索IEX-1的表达与HPV感染的相关性及其可能涉及的机制。本课题将为明确宫颈癌变过程中IEX-1的作用及研究其与HPV的相互作用提供理论依据。材料与方法1.人宫颈癌细胞株Si Ha(HPV16+)、He La(HPV18+)、C-33a(HPV-)均由华中科技大学惠赠。收集2010年1月到2014年10月在郑州大学第一附属医院病理科存档蜡块标本132份(其中手术标本124例,活检标本8例)。其中正常宫颈29例,年龄32-61岁;CIN 46例(Ⅰ级19例、Ⅱ级17例、Ⅲ级10例),年龄29-58岁;宫颈癌57例(鳞癌35例、腺癌22例),年龄27-65岁。宫颈癌根据FIGO临床病例分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期26例,Ⅲ期6例,Ⅳ期2例。分化等级:高分化13例,中分化18例,低分化26例。2.免疫组化SP法检测IEX-1在正常宫颈组织、CIN组织及宫颈癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系。3.以RT-q PCR法检测Si Ha、He La、C-33a宫颈癌细胞系中IEX-1表达,Western Blot法检测Si Ha、He La、C-33a宫颈癌细胞系中IEX-1蛋白质表达。4.RT-q PCR和Western Blot法检测E6特异性si RNA干扰Si Ha细胞前后Si Ha细胞中E6及IEX-1的m RNA及蛋白表达水平。5.统计学处理:采用SPSS17.0软件统计分析,定性资料比较采用卡方检验,定量资料比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。两两比较采用Bonferroni法检验矫正检验系数。结果1.免疫组化法显示:IEX-1在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈癌组织中的表达依次减少,三者之间差异有统计学意义(c2=75.905,P=0.000<0.017)。IEX-1在宫颈癌组织中的表达与患者年龄、病理类型及FIGO分期均无关(均P>0.05)。IEX-1的表达与宫颈癌分化程度及肌层浸润深度相关。分化程度越低,IEX-1蛋白阳性表达率越低(c2=6.642,P=0.009<0.05);深肌层浸润者IEX-1蛋白阳性表达率明显低于仅浅肌层浸润者(c2=5.076,P=0.025<0.05)。2.RT-q PCR法分别检测Si Ha细胞、He La细胞和C-33a细胞中IEX-1 m RNA表达水平显示:IEX-1 m RNA在C-33a细胞中表达(21.652±9.020)高于Si Ha细胞(1.006±0.027)和He La细胞(1.742±0.854)(PSi Ha-C-33a=0.003<0.05,PHe La-C-33a=0.003<0.05)。Si Ha细胞和He La细胞间IEX-1m RNA表达无明显差异(PSi Ha-He La=0.868>0.05)。3.Western Blot法分别检测Si Ha细胞、He La细胞和C-33a细胞中IEX-1蛋白的表达水平显示:IEX-1蛋白在C-33a细胞(18.017±1.351)中表达高于Si Ha细胞(1.028±0.039)和He La细胞(2.004±0.363)(PSi Ha-C-33a<0.001,PHe La-C-33a<0.001)。Si Ha细胞和He La细胞间IEX-1蛋白表达无明显差异(PSi Ha-He La=0.152>0.05)。4.将Si Ha细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组,干扰组转染入E6特异性Si RNA核苷酸序列,阴性对照组转入无义RNA核苷酸序列,空白对照组使用RNase-free water代替。转染后用RT-q PCR法分别检测干扰组、阴性对照组和空白对照组E6 m RNA和IEX-1 m RNA表达水平显示:E6 m RNA在干扰组(0.218±0.106)表达水平明显低于阴性对照组(1.031±0.072)及空白对照组(1.003±0.015)(P干扰-阴性对照<0.001,P干扰-空白对照<0.001),E6 m RNA表达水平在阴性对照组和空白对照组差异无统计学意义(P阴性对照-空白对照=0.207>0.05)。IEX-1m RNA在干扰组(20.083±0.672)表达水平明显高于阴性对照组(1.613±0.408)及空白对照组(1.018±0.032)(P干扰-阴性对照<0.001,P干扰-空白对照<0.001),IEX-1 m RNA表达水平在阴性对照组和空白对照组差异无统计学意义(P阴性对照-空白对照=0.304>0.05)5.转染后用Western Blot法分别检测干扰组、阴性对照组和空白对照组E6、IEX-1蛋白表达水平显示:E6蛋白在干扰组(0.184±0.274)表达水平均明显低于阴性对照组(0.692±0.133)及空白对照组(0.783±0.097)(P干扰-阴性对照<0.001,P干扰-空白对照<0.001),E6蛋白表达水平在阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义(P阴性对照-空白对照=0.184>0.05)。IEX-1蛋白在干扰组(0.672±0.135)表达水平均明显高于阴性对照组(0.137±0.071)及空白对照组(0.081±0.009)(P干扰-阴性对照=0.001<0.05,P干扰-空白对照<0.001),IEX-1蛋白表达水平在阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义(P阴性对照-空白对照=0.094>0.05)结论1.IEX-1在宫颈癌组织中表达减低,其表达水平与宫颈癌恶性程度呈负相关,宫颈上皮细胞中IEX-1的表达减低或缺失可能参与了宫颈癌的发生与发展。2.IEX-1在宫颈癌细胞中的表达水平与HPV感染与否呈负相关,与感染的HPV型别无关,IEX-1与HPV在宫颈癌变过程中可能发挥相反作用。3.E6特异性Si RNA可沉默宫颈癌细胞系中E6蛋白的表达。宫颈癌细胞系中HPV E6沉默后,IEX-1表达上调,HPV可能通过E6癌蛋白下调了IEX-1的表达。