【摘 要】
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背景:肝纤维化是肝脏在受到外界或者内在因素刺激后,损伤在不断修复的一种反应,这种反应的特点是肝损伤后细胞产生的细胞外基质(ECM)的异常积累。当损伤持续存在,肝脏的损伤修复反复进行,导致Ⅰ型胶原等组成的细胞外基质持续集聚在肝脏中,修复愈合的瘢痕组织逐步增厚并逐渐取代肝实质,使肝纤维化不断发展,最终可导致肝硬化甚至肝癌等高死亡率疾病。针对这一机制,人们已经明确活化态的肝星状细胞是细胞外基质合成分泌的
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背景:肝纤维化是肝脏在受到外界或者内在因素刺激后,损伤在不断修复的一种反应,这种反应的特点是肝损伤后细胞产生的细胞外基质(ECM)的异常积累。当损伤持续存在,肝脏的损伤修复反复进行,导致Ⅰ型胶原等组成的细胞外基质持续集聚在肝脏中,修复愈合的瘢痕组织逐步增厚并逐渐取代肝实质,使肝纤维化不断发展,最终可导致肝硬化甚至肝癌等高死亡率疾病。针对这一机制,人们已经明确活化态的肝星状细胞是细胞外基质合成分泌的主要来源,因此针对活化态肝星状细胞的研究十分重要。最近的研究表明,肝星状细胞的活化受到表观遗传学,特别是micro RNA(miRNA)的调节。micro RNA对肝星状细胞相关的活化与增殖功能有显著的影响。我们实验团队在前期实验研究中发现从四氯化碳导致的肝纤维化损伤小鼠中分离出的HSC中miR-195-3p表达显著上调,并且随着肝纤维化程度的增加,上调更明显,此外,在体外转化生长因子β(TGF-β1)诱导的人类永生化的肝星形细胞系(LX-2 cell)体外模型中,miR-195-3p的表达显著上调,这说明miR-195-3p在肝纤维化发生发展过程中可能发挥着调控作用,但对于其具体调控机制及调控功能尚不清楚。目的:研究miR-195-3p在肝纤维化中可能的调控作用,及其下游靶基因方法:我们首先在体外静息态LX-2细胞中使用miR-195-3p mimics过表达miR-195-3p。Western blott,RT-q PCR,Ed U等方式针对高表达的miR-195-3p对LX-2活化增殖相关功能的作用进行检测。相反的,在活化态的LX-2细胞中使用miR-195-3p inhibitor敲低miR-195-3p的表达后,同样检测细胞活化增殖的变化。在验证了miR-195-3p对LX-2细胞功能的调控作用后,我们对其具体的调控机制展开研究,miRNA通过靶向结合下游基因m RNA的3’UTR进而发挥其重要调控作用。因此我们通过Target Scan网站对miR-195-3p的潜在的下游靶基因进行预测,并对预测的结果展开验证研究。首先,为了证实miR-195-3p与预测靶基因是否确定结合,我们采取了双荧光素酶报告实验,其次,检测预测靶基因的表达在肝脏损伤小鼠的肝脏组织以及分离出的肝星状细胞中的表达,以及在TGF-β1刺激后的LX-2细胞中的表达。紧接着我们将miR-195-3p mimics及预测靶基因的过表达质粒使用相同方法一起转染进LX-2细胞中,另一方面将miR-195-3p inhibitor与预测靶基因的小干扰RNA一起转染进LX-2细胞中。进一步我们对miR-195-3p靶基因调控轴的下游通路进行研究,通过文献数据查询靶基因的下游调控通路,接着在LX-2细胞中转染miR-195-3p mimics/inhibitor,检测下游调控通路相关基因的表达水平变化。结果:通过对比结果发现,过表达miR-195-3p后促进了LX-2细胞的增殖,同时纤维化相关的标记蛋白α-SMA,Col1a1以及增殖相关的cyclin D1,C-myc表达均上调,说明LX-2细胞由静止态转变为活化态。相反的,敲低miR-195-3p的表达后,LX-2细胞增殖减少,并且纤维化相关标记蛋白以及细胞增殖相关蛋白表达减少,表明LX-2细胞由活化态转变为静息态。Target Scan网站预测发现在miR-195-3p的下游靶基因中PTEN在多种纤维化疾病中有调控作用,而PTEN的表达在肝脏损伤小鼠的肝脏组织以及分离出的肝星状细胞中表达下调,并且在TGF-β1刺激后的LX-2细胞中表达也下调。在miR-195-3p mimics与PTEN的过表达质粒共转染后,观察到miR-195-3p高表达对LX-2的调控作用受到了高表达PTEN的部分抑制,同样的,当miR-195-3p inhibitor与PTEN小干扰RNA(si RNA)共转染后,miR-195-3p地表达产生的调控作用被PTEN si RNA部分抑制。通过查阅文献可以查到PTEN在PI3K/Akt/mTOR信号通路中发挥调控影响。我们在转染miR-195-3p mimics后的LX-2细胞中检测PI3K/Akt/mTOR调控通路相关基因Akt/p-Akt以及mTOR/p-mTOR蛋白水平表达显著上调,相反的在转染了miRNA-195-3p inhibitor后的LX-2细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达受到抑制。结论:miR-195-3p/PTEN/PI3K/Akt/mTOR轴在肝星状细胞活化和增殖,诱导促成纤维化基因的表达中发挥重要调控作用,并且有作为肝纤维化治疗靶点的可能。
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