背景：心肌缺血再灌注损伤指缺血心肌在恢复血流再灌注后,反而加重其结构破坏,引起细胞死亡,导致梗死范围扩大,造成心功能的进一步损害并影响心肌梗死患者的预后。心肌缺血再灌注损伤的发病机制较复杂,氧自由基、钙超载、炎症介质是比较公认的机制,其中炎症反应是造成心肌缺血再灌注损伤损伤的重要原因之一。如何揭示其发病的关键环节及合理的干预以减少缺血再灌注后炎症反应是目前研究的热点,也是本课题研究的出发点。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein1,HMGB1)是一种重要的“晚期”炎性细胞因子,HMGB1还可能是致炎细胞因子调控网络中的一个中心环节,炎症反应的晚期,HMGB1释放增加,释放入血的HMGB1通过内分泌和旁分泌的形式导致炎症级联反应的进一步扩大。HMGB1作为一种重要的“晚期”炎性细胞因子不仅能促使TNF-a、IL-1等表达,还能激活ERK激酶、P38MAP K激酶、JNK激酶并促使核转录因子NF-K B发生核移位。这些研究提示,HMGB1可能是致炎细胞因子调控网络中的一个中心环节,不仅自身分泌有级联放大的生物学效应,还能调节其他炎症因子的分泌,是直接导致缺血再灌注损伤的“晚期”重要介质。而寻找一种药物抑制HMGBl,减轻炎症反应,成为了减轻心肌缺血再灌注损伤的重要靶点。甘草甜素(Glcyrrhizin,GL)是一种提取甘草根部的活性组分,具有抗炎症、免疫调节作用、抗过敏等作用。大量的文献证实甘草甜素可以通过抑制炎症反应,减轻脑、脊髓、肠道、肝脏等器官的缺血再灌注损伤,而其在心肌缺血再灌注损伤中是否同样具有保护作用,目前国内外均尚未见研究,这也是本研究的主要出发点之一。总上所述,我们设计了甘草甜素干预心肌缺血再灌注损伤的实验,证实其是否具有心肌保护作用,以及与HMGB1的关系,进一步阐述甘草甜素在缺血再灌注损伤中的保护机制。实验目的：1.建立大鼠心肌缺血再灌注模型。2.观察实验各组缺血再灌注大鼠血流动力学情况变化。3.观察实验各组缺血再灌注大鼠心肌缺血坏死情况及其病理改变。4.观察实验各组炎症因子的表达以及HMGB1的表达情况。实验方法：实验大鼠分为：假手术(Sham)组：共10只,术前7天,每天大鼠尾静脉注射生理盐水1ml,模型建立时只穿线,不结扎；缺血再灌注组(NS)：术前7天,每天大鼠尾静脉注射生理盐水1ml。结扎冠状血流30分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成I/R损伤模型；甘草甜素干预(GL)组：术前7天,每天大鼠尾静脉注射甘草甜素预处理(10mg/kg),甘草甜素+重组HMGB1组(GL+rHMGB1)：术前7天,每天大鼠尾静脉注射甘草甜素预处理(10mg/kg)。结扎冠脉血流30分钟后大鼠尾静脉立即给予重组HMGB1(100μg/鼠)。实验结扎冠状血流30分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成心肌缺血再灌注损伤模型,进行有关指标的检测。检测各组造模后从0分钟到24小时血清HMGB1水平,炎性细胞因子水平以及血流动力学指标,并检测其相关梗死面积及病理变化。实验结果：1：实验各组之间血流动力学指标：心率、平均动脉压、收缩压乘积等无明显差异(P>0.05)。2：NS组心肌梗死面积最大(P<0.05),GL可以减少心肌梗死面积(P<0.05), GL+rHMGBl组心肌梗死面积较GL组明显(P<0.05),但仍低于NS组(P<0.05)；而且各组之间心肌缺血面积无明显统计学差异。3:Sham组大鼠心肌纤维完整,细胞核、细胞浆完整；NS组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞有破裂及溶解现象,可见坏死细胞,炎细胞浸润。GL组心肌细胞部分间质有水肿,少量炎细胞浸润,GL+HMGB1组心肌细胞排列紊乱,染色不均,可见细胞水肿,点状坏死,较NS组减少(P<0.05)4：NS组心肌肌钙蛋白,LDH, AST等水平最高(P<0.05),GL组较NS组下降(P<0.05),GL+rHMGB1组心肌梗死面积较GL组增加(P<0.05),但仍低于NS组(P<0.05)；5：NS组HMGB1水平和炎性细胞因子TNF-α,IL-6水平最高(P<0.05),GL组血清HMGBl水平和炎性细胞因子TNF-α,IL-6等水平显著降低(P<0.05)。实验结论及意义：1：HMGBl可以增加心肌缺血再灌注损伤中炎性细胞因子TNF-α,IL-6等表达,增加心肌梗死面积。2：GL可能通过抑制心肌缺血再灌注后HMGB1的表达,减轻炎症反应,减少心肌缺血再灌注损伤。背景：甘草甜素是一种提取甘草根部的活性组分,具有抗炎症、免疫调节作用、抗过敏等作用。国外学者已有报告其对缺血再灌注诱导损伤实验动物器官如脊椎,肝脏和大脑等有保护作用,同时在我们前面的课题中已证实甘草甜素在心肌缺血再灌注损伤中同样具有保护作用。但甘草甜素干预对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响尚未有报道,这是本课题的出发点之一。近年来人们对凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的认识逐渐加深,细胞凋亡是细胞程序性死亡,心肌缺血再灌注损伤时心肌凋亡是其中重要机制之一,减少心肌细胞凋亡,可以明显改善心功能。Bax和Bcl-2基因是调控凋亡的主要基因,其蛋白水平高低与凋亡调控直接相关：Bax增加,促进细胞凋亡,Bcl-2增加,抑制细胞凋亡。细胞色素C (Cyt C)从线粒体释放后可以诱导Bax基因从线粒体释放到细胞质,引起细胞凋亡,而Bcl-2可以阻止细胞色素C的释放,抑制细胞凋亡。Caspases酶是细胞凋亡的关键酶,其中Caspases-3是Caspases级联瀑布下游最关键的凋亡蛋白酶,Bax蛋白可以使细胞色素C通过线粒体膜,激活Caspases-9,进一步激活Caspases-3,导致细胞凋亡。由上可见Bax、Cyt C以及Caspase-3等蛋白在细胞凋亡中发挥了重要的作用,所以在我们的课题中,对甘草甜素干预对Bax、Cyt C等的影响也进行了相关的研究。最近丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径在心肌细胞凋亡中的作用日益受到关注。MAPK有4个主要的亚家族：细胞外信号调节激酶(ERK1/2),细胞外信号调节激酶5(ERK5),c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)。本课题的出发点在于证实甘草甜素对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响,其分子机制是否与蛋白激酶(MAPK)途径,特别是JNK通路有关。针对这一问题进行了本研究,进一步探讨其保护心肌缺血再灌注损伤的机制。实验目的：1.明确甘草甜素干预后各组心肌细胞凋亡的情况。2.明确甘草甜素干预对心肌Bax、Cyt C表达以及Caspase3活性等的影响。3.研究甘草甜素对磷酸激酶相关信号通路的影响,特别是JNK通路的关系,进一步阐述其对缺血再灌注心肌凋亡的影响,及其心肌保护作用的机制。实验方法：实验大鼠分为：假手术(Sham)组：共10只,术前7天,每天大鼠尾静脉注射生理盐水lml,模型建立时只穿线,不结扎；缺血再灌注组(NS)：术前7天,每天大鼠尾静脉注射生理盐水lml。结扎冠状血流30分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成I/R损伤模型；甘草甜素干预(GL)组：术前7天,每天大鼠尾静脉注射甘草甜素预处理(10mg/kg),甘草甜素+重组HMGBl组(GL+rHMGB1)组：术前7天,每天大鼠尾静脉注射甘草甜素预处理(10mg/kg)。结扎冠脉血流30分钟后大鼠尾静脉立即给予重组HMGB1(100μg／鼠)。实验结扎冠状血流30分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成心肌缺血再灌注损伤模型,进行有关指标的检测。Tunnel染色检测心肌细胞凋亡情况,免疫印迹法检测心肌凋亡Bax、Cyt C基因,心肌细胞caspase-3活性。此外,还对缺血再灌注诱导的蛋白激酶家族包括ERK1/2、JNK以及p38磷酸化进行了分析。实验结果：1.Tunnel染色结果提示NS组心肌细胞凋亡最明显(P<0.05),GL组心肌细胞凋亡程度较之下降(P<0.05),GL+rHMGBl组心肌凋亡较GL组较明显,但仍低于NS组(P<0.05)；2：免疫印迹法显示GL可以改变Bax基因和Cyt C的细胞内分布,抑制凋亡过程中Bax基因从细胞质向线粒体转移,并使细胞色素C从线粒体到细胞质转移减少,而甘草甜素+重组HMGB1组的抑制作用减弱(P<0.05)；总体细胞水平未见Bax及细胞色素C的变化(P>0.05)3：GL可以抑制JNK细胞通路磷酸化(P<0.05),而对ERK1/2或P38磷酸化无影响(P>0.05),而GL+rHMGBl组的抑制作用减弱,但JJNK磷酸化水平仍低于NS组(P<0.05)实验结论及意义：1：甘草甜素可以改变Bax基因和Cyt C的分布,减轻再灌注后心肌凋亡,对心肌有保护作用。2：甘草甜素减轻心肌细胞凋亡,对缺血再灌注大鼠的心肌保护机制可能与抑制JNK磷酸化有关背景：缺血再灌注损伤是指组织器官如心、脑、肾等在一定时间的缺血后,在重新恢复血供后,不仅不能恢复改善组织器官的功能,反而起到加重功能代谢障碍以及组织损害,其中实验表明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径介导的细胞凋亡参与了缺血再灌注的发生。其中JNK细胞通路在心肌缺血后细胞凋亡的信号转导途径中起重要作用,其作为细胞因子信号传导的重要途径,广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节、炎症、肿瘤等多种生理、病理生理过程,在缺血再灌注、心脏骤停、炎症反应等中起到了重要作用。细胞凋亡是一种主动地、程序性和生理性的细胞死亡,指在一定条件下,核细胞通过启动内部机制,通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程,表现为一系列的细胞核变化。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是促分裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)成员之一,位于细胞胞质之中,可被炎症介质、细胞因子、休克创伤、缺血再灌注等多种因素激活,大量实验表明JNK细胞通路参与了细胞凋亡的病理生理过程。研究表明缺血再灌注后数分钟就可以发现线粒体及细胞质JNK被激活,可见其在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用；有学者研究发现心肌缺血区JNK活性明显增加,采用JNK抑制剂SP600125可以阻断Bax凋亡途径；同样在大鼠脑缺血再灌注模型中,采用JNK抑制剂AS601245可以明显降低缺血再灌注引起的神经细胞的凋亡,有学者在肝缺血再灌注模型中发现再灌注后JNK活性明显升高,采用JNK抑制剂可以明显缓解肝细胞的凋亡。本课题采用了JNK抑制剂SP600125以及重组HMGB1进行了干预,证实JNK通路以及HMGB1在缺血再灌注损伤中的作用,从而为甘草甜素通过抑制HMGB1以及抑制JNK磷酸化,对缺血再灌注心肌起到保护作用的机制提供一定的论据。针对这些问题,我们设计了本实验,明确JNK通路及HMGB1在心肌缺血再灌注中细胞凋亡的意义,进一步阐述心肌缺血再灌注损伤的机制。实验目的：1.建立大鼠心肌缺血再灌注模型,观察实验各组缺血再灌注大鼠心肌凋亡情况,观察心肌Bax, CytochromeC, Caspase3的表达情况。2.并用JNK抑制剂SP600125以及重组HMGB1进行干预,明确JNK通路以及HMGB1在心肌缺血再灌注中细胞凋亡的意义,进一步证实甘草甜素的心肌缺血再灌注损伤的机制。实验方法：实验大鼠分为：缺血再灌注组(NS组)：共10只,冠脉结扎前30分钟大鼠尾静脉注射生理盐水lml,结扎冠状血流30分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成I/R损伤模型；SP600125干预组(NS+SP600125组)：冠脉结扎前30分钟,大鼠尾静脉注射SP600125溶液1ml (0.5mg/kg),结扎冠状血流30-分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成I/R损伤模型,24小时后进行有关指标的检测。SP600125+重组HMGB1干预组(SP600125+rHMGB1组)：冠脉结扎前30分钟,经大鼠尾静脉注射SP600125溶液lml预处理(0.5mg/kg),结扎前大鼠尾静脉立即给予重组HMGB1(100μg／鼠),结扎冠状血流30分钟,放松结扎线后再灌注1小时,造成I/R损伤模型,24小时后进行有关指标的检测,Tunnel染色检测心肌细胞凋亡情况,免疫印迹法检测心肌凋亡Bax、Cyt C蛋白,心肌细胞caspase-3以及JNK活性。实验结果1：免疫印迹法显示NS组JNK活性最强(P<0.05),NS+SP600125组JNK活性最弱(P<0.05)2:Tunnel染色结果提示NS组心肌细胞凋亡最明显(P<0.05),NS+SP600125组心肌细胞凋亡程度较之下降(P<0.05),SP600125+rHMGB1组心肌凋亡较NS+SP600125组较明显,但仍低于NS组(P<0.05)；3：免疫印迹法显示SP600125可以改变Bax基因和Cyt C的细胞内分布,抑制凋亡过程中Bax基因从细胞质向线粒体转移,并使细胞色素C从线粒体到细胞质转移减少,而SP600125+rHMGB1组的抑制作用减弱(P<0.05)；总体细胞水平未见Bax及细胞色素C的变化(P>0.05)。实验结论及意义：1:HMGB1干预可以加重缺血再灌注损伤,为甘草甜素抑制HMGB1的保护机制提供了实验依据。2：JNK细胞通路在缺血再灌注心肌损伤时起到重要作用,干预JNK途径可以减轻再灌注损伤,为甘草甜素抑制JNK磷酸化保护缺血再灌注心肌提供了理论依据。