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本实验对汾酒酒醅、酒糟、曲粉、曲块和湿曲5种样品中的芽孢杆菌进行了初步的分离,并对分离到的芽孢杆菌进行了形态观察和生理生化特征分析。然后,用透明圈测定法对分离到的芽孢杆菌进行了产高温蛋白酶能力的比较。在此基础上,对筛选到的产高温蛋白酶能力强的芽孢杆菌菌株进行了产酶条件研究。 从5种样品中共分离到42株芽孢杆菌,它们在营养肉汁胨培养基上的菌落特征为乳白色、圆形或不规则、湿润、不透明、边缘不整齐、多数有褶皱、部分有轮回。测定了42株芽孢杆菌的生理生化性质,结果表明:42个菌株的触酶反应均为阳性;V-P试验多为阳性,反映终产物的pH值在5.2~6.7之间;所有的菌株明胶水解试验均为阳性;多数菌株能在55℃下生长,只有4个菌株能在65℃下生长;多数菌株淀粉水解阳性;酪朊水解实验表明只有3个菌株为酪朊水解阴性,其他均为阳性。 通过在酪蛋白琼脂平板上测定透明圈筛选得到1株在45℃下产蛋白酶能力很强的菌株,编号为W20。芽孢染色镜检结果表明W20菌株芽孢椭圆,孢囊膨大,菌体呈短杆状,芽孢的位置中生和偏生,结合生理生化实验结果,初步鉴定W20菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。 实验通过点式接种和划线接种的对比发现点式接种是测透明圈较理想的接种方式,而培养基的优化选择结果表明酪蛋白琼脂培养基是透明圈测定较理想的培养基。测定了W20和对照菌株1017、1020的产酶条件,结果显示1017和1020菌株的最适产酶温度为40℃,W20的产酶最适温度为55℃;3个菌株的产酶能力随pH的升高先增强后减弱,在pH为8时产酶能力最强,并且W20的最高酶活比两个对照菌株的最高酶活要高。 摇瓶发酵培养后,通过福林法分别测定发酵液的蛋白酶活力。结果表明:对照菌株1017、1020在40℃下酶活最高,分别为577.02U/mL、657.82U/mL,当温度提高到55℃时,1017、1020菌株因耐热性差而终止产酶,而W20在55℃时酶活力可达708.33U/mL,这个结果与前面的透明圈测定结果相吻合。 实验还测定了W20和对照菌株1017、1020在麸皮培养基上酶解产生游离氨基酸的能力。茚三酮显色结果显示3个菌株培养物中总氨基酸含量随着培养时间的变化先增加后减少,说明当蛋白被水解完后氨基酸又部分被利用。培养72h时相同接种量的3种培养物经100mL蒸馏水浸提,茚三酮显色法测得的样品的游离氨基酸浓度分别为88.91μg/mL、62.80μg/mL和22.43μg/mL。50℃下、接种菌数为8.0×106时,W20在含水量为52.4%的21g麸皮培养基中产生的游离氨基酸总量为8.89mg,其分解蛋白质产生氨基酸的能力明显强于两个对照菌株。