研究目的和意义:自20世纪80年代起,肺癌已经逐步成为全球范围内发病率及致死率最高的癌症之一,而且发病率和致死率呈现逐年上升的趋势,跟据2016年美国癌症学会的调查统计数据显示,肺癌在男性和女性患者中的平均致死率分别为27%和26%,位居恶性肿瘤致死率之首。在我国,肺癌的发病率和病死率逐年上升,已经成为对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。近年来,随着肺癌突变基因研究的不断深入和大量靶向药物的研究应用,肺癌的治疗逐步向以基因为导向的个体化治疗转变。在过去,人们将肺癌个体化治疗研究的重点放在编码基因上,而随着研究的不断深入人们发现长链非编码RNA(long non coding RNA,lnc RNA)在恶性肿瘤发生发展过程中起着不可忽视的重要作用,同时其显著的肿瘤组织特异性及其应用于肿瘤诊断的可能性也使其日益成为肿瘤研究中新的热点。随着测序技术的不断发展,越来越多的研究者采用高通量基因组筛选技术,根据基因功能来鉴别新型肺癌。试图在对肺癌进行有效分型的基础上开发更精确的诊断工具,从而对肺癌进行更好的治疗。本研究的目的是通过转录组测序技术(RNA-Seq)对不同亚型肺癌组织进行全基因组lnc RNA差异表达分析,以发现在肺腺癌组织中存在异常表达并且与肺腺癌病人预后密切相关的lnc RNA,并且探讨肺腺癌特异性lnc RNA在肺腺癌发生发展中的作用。研究方法:(1)通过RNA-Seq技术检测肺癌相关的基因;(2)发现和识别潜在的肺腺癌lnc RNA分子诊断标志物;(3)发现和识别肺腺癌潜在的lnc RNA预后生存标志物;(4)用q RT-PCR的方法验证肺腺癌异常表达的linc00857在独立肺腺癌组织及癌旁正常肺组织样品集中(样品集合包括101例肺癌组织,19例正常肺组织)的表达;(5)通过COX比例风险模型分析和Kaplan-Meier曲线进行生存分析(总生存率的计算以手术治疗后五年生存期为限),明确linc00857在独立样本库中对肺腺癌病人生存的影响,进而分析linc00857与临床肺腺癌分期、淋巴结转移等病理特征的相关性;(6)选取linc00857高表达肺腺癌细胞系,分离提取胞浆和胞核RNA,利用q RT-PCR技术检测linc00857在胞浆和胞核中的分布情况;(7)采用WST-1实验,小室侵袭、转移实验,划痕实验,平板克隆形成实验对linc00857进行功能性研究;(8)采用SCID小鼠人肺腺癌细胞皮下移植瘤模型研究linc00857在体内对肺腺癌细胞的作用;(9)通过流式细胞术明确linc00857对肺腺癌细胞周期的影响;(10)通过Affymetrix ST2.1 exon microarray基因芯片研究linc00857和其他基因之间的关系,发现linc00857潜在的调控通路;(11)通过RT-PCR、Westernblot方法验证蛋白和RNA改变。研究结果:一、通过RNA-Seq技术检测肺腺癌特异性lnc RNA及验证1.通过RNA-Seq技术检测肺癌相关的基因:采用Illumina Hi-Seq 2000对145例肺癌相关样品进行测序和生物学分析后,一共筛选得到21560个基因,包括16017个蛋白编码基因(占74%),1726个假基因(占8%)和3136个lnc RNA(占15%)2.发现和识别潜在的肺腺癌lnc RNA分子诊断标志物:将我们的RNASeq结果与另外两个已发表的独立RNA-Seq数据库进行综合分析,共筛选出281个肺腺癌特异性表达的lnc RNA。3.发现和识别肺腺癌潜在的lnc RNA预后生存标志物:对281个肺腺癌特异性表达的lnc RNA分别进行生存分析,一共发现有127个与生存密切相关的lnc RNA。之后在已发表的Okayama肺腺癌数据库(Okayma M.Cancer Res.,2011,Affymetrix U133 plus 2.0 array方法测得,包括226例一期和二期肺腺癌组织)对结果进行了验证,发现127个lnc RNA中有54个在Okayama数据库中也与肺腺癌病人生存相关,其中34个的p值小于0.01。4.综合评定各项指标,选取肺腺癌中异常高表达并且与肺腺癌病人不良预后密切相关的linc00857作为研究对象。5.q RT-PCR验证:发现肺腺癌组织中linc00857基因异常高表达,与RNA-Seq结果显著相关,(p<0.05),同时生存分析发现高表达的linc00857与肺腺癌病人不良预后密切相关(p<0.05)。二、lnc RNA linc00857在肺腺癌细胞中的功能性研究1.WST-1实验表明敲低linc00857之后,肺腺癌H1299和H838细胞的增殖能力被显著抑制(p<0.01);2.平板克隆形成实验表明linc00857表达下调之后可显著抑制H1299和H838细胞克隆形成能力(p<0.01);3.Transwell侵袭和转移实验表明linc00857表达下调之后H1299和H838侵袭和转移能力被显著性抑制;4.通过裸鼠皮下荷瘤实验发现与对照组相比linc00857敲低的H1299细胞皮下成瘤能力显著性降低。三、肺腺癌特异性lnc RNA linc00857的初步机制研究1.分别检测linc00857在细胞核和细胞质中的表达,发现linc00857在肺腺癌细胞系H1299和H838细胞核、细胞质中均有分布,而且linc00857在细胞质中的表达要高于其在细胞核中的表达。2.采用Affymetrix ST2.1 exon microarray芯片研究linc00857能够调控的肺腺癌相关基因及其所在的信号通路,发现linc00857敲低表达后H1299和H838细胞中共有136个基因的表达被下调,共有116个基因的表达都被上调。3.通过对Affymetrix SNP6.0芯片的结果和RNA芯片结果的分析发现,Linc00857对它基因组临近的基因ANXA11和MAT1A并无显著性影响,提示Linc00857并不是通过调节其基因组临近基因起到作用。4.对在Okayama数据库和UM RNA-Seq数据库中与linc00857正相关的基因进行了DAVID Gene Ontology分析发现,大部分与linc00857正相关的基因都与细胞周期进程显著性相关。5.通过流式细胞术和Western Blot验证发现干扰linc00857表达之后周期相关蛋白CDK2和CCNE1的表达降低。这表明linc00857能够通过调节周期相关蛋白从而影响细胞周期进程,进而影响肺腺癌细胞的增殖。研究结论及意义:1.通过RNA-Seq和生物信息学技术,首次发现肺腺癌中存在异常表达并且与肺腺癌病人预后显著相关的长链非编码RNA集合。2.首次发现并证实长链非编码RNA linc00857在肺腺癌组织中特异性高表达,并且与肺腺癌病人的不良预后密切相关。3.通过功能学实验发现,敲低长链非编码RNA linc00857表达后,可显著抑制肺腺癌细胞H838和H1299体外增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力,抑制H1299在小鼠体内的增殖能力。4.发现linc00857敲低之后能够显著性引起周期相关基因的改变,使细胞周期阻滞在G1/S期,并且能显著性的抑制细胞周期进程相关蛋白CDK2和CCNE1的表达。以上研究表明肺腺癌中存在异常表达并且与病人预后相关的lnc RNA,其中linc00857在肺腺癌中异常高表达并且与肺腺癌的不良预后密切相关,能通过调节细胞周期进程影响肺腺癌细胞的增殖,具备成为肺腺癌分子诊断/预后标志物的潜能。