【摘 要】
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目的:本实验在体外研究槲皮素对口腔癌细胞生物学行为的影响,结合前期测序结果筛选出miR-181a-5p作为目的基因分析该基因在口腔癌发生发展中发挥的功能以及作为治疗靶点的可能性。分析槲皮素与miR-181a-5p对口腔癌的抗肿瘤效应及调控分子机制,为临床肿瘤治疗提供一种新的策略。方法:1.不同浓度槲皮素处理Tca-8113和Cal-27细胞系（Tca-8113:0,200,250,300,350,
【基金项目】
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国家自然科学基金“基于转录组和microRNA分析中国地鼠口腔黏膜癌发生的表观遗传学机制（编号:31772551）；
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目的:本实验在体外研究槲皮素对口腔癌细胞生物学行为的影响,结合前期测序结果筛选出miR-181a-5p作为目的基因分析该基因在口腔癌发生发展中发挥的功能以及作为治疗靶点的可能性。分析槲皮素与miR-181a-5p对口腔癌的抗肿瘤效应及调控分子机制,为临床肿瘤治疗提供一种新的策略。方法:1.不同浓度槲皮素处理Tca-8113和Cal-27细胞系（Tca-8113:0,200,250,300,350,400μg/m L;Cal-27:0,100,200,300,400,500μg/m L）,4μg/m L的顺铂作阳性对照。分别培养24 h,48 h,72 h后,CCK-8法检测口腔癌细胞增殖情况,筛选出槲皮素最佳浓度及作用时间用于后续研究;采用流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期;Transwell（添加基质胶）检测细胞的迁移（侵袭）;使用q PCR检测细胞处理前后的miR-181a-5p表达水平;Western Blotting检测各组细胞中PTEN、BCL2L11蛋白的表达。2.使用脂质体Lipofectamine RNAi MAX Reagent瞬时转染miR-181a-5p mimics和无关序列。将细胞分为miR-181a-5p mimics转染组、miR-181a-5p mimics转染+槲皮素组、无关序列组（NC）、槲皮素组以及对照组。转染结束后分别对细胞的增殖、迁移及侵袭能力进行检测;使用q PCR检测各组细胞中Akt、FOXO1、PTEN及BCL2L11的m RNA表达水平;Western Blotting检测Akt、p-Akt、FOXO1、p-FOXO1、PTEN和BCL2L11的蛋白表达。结果:1.不同浓度的槲皮素对口腔癌细胞生物学行为的影响:与对照组相比,槲皮素实验组Tca-8113和Cal-27细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著减弱,细胞凋亡增加并显示出明显的细胞周期阻滞;筛选出最佳浓度为350μg/m L（Tca-8113）和400μg/m L（Cal-27）及最佳作用时间为24h;miR-181a-5p,PTEN及BCL2L11的表达均显著上升（P<0.05）。2.槲皮素以及miR-181a-5p对PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响:Western Blotting结果显示与对照组相比,槲皮素或miR-181a-5p单独处理细胞后,PTEN和BCL2L11在m RNA和蛋白水平均上调（P<0.05）;Akt和FOXO1磷酸化水平显著下降,但Akt和FOXO1的m RNA和蛋白水平没有显著差异（P>0.05）。说明槲皮素以及miR-181a-5p可能通过影响PI3K/Akt通路发挥抑癌作用。3.槲皮素联合miR-181a-5p对PI3K/Akt通路相关蛋白的作用:在细胞中转染miR-181a-5p并给予槲皮素后,与对照组相比PTEN和BCL2L11的m RNA和蛋白表达均上调（P<0.05）;磷酸化的Akt和FOXO1蛋白表达显著下降,但Akt和FOXO1在m RNA和蛋白水平均没有显著差异（P>0.05）,呈现出与槲皮素和miR-181a-5p单独使用时相似的趋势,但是又比单独使用时展现出更强的作用效果（P<0.05）。说明上调miR-181a-5p并给予槲皮素后对PI3K/Akt通路相关蛋白的作用更强。结论:1.槲皮素可抑制口腔癌细胞的增殖、迁移及侵袭,促进细胞凋亡并导致周期阻滞,其抗肿瘤作用可能与上调miR-181a-5p、PTEN和BCL2L11有关。2.槲皮素可与miR-181a-5p发挥协同抗肿瘤作用,其机制可能是两者共同促进PTEN表达,负调控PI3K/Akt通路,减弱FOXO1磷酸化水平,并引起BCL2L11的表达增加实现的。
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