环磷酰胺(Cyclophophamide，CPA)是临床常用的化疗药物，在系统性红斑狼疮(systemic Iupus erythematousus，SLE)的治疗上占有重要地位，其本身无细胞毒性及免疫抑制作用，进入体内后经细胞色素P450酶(CYP450)代谢才能发挥作用，不同个体间代谢速度差异很大。CPA经CYPs代谢为活性代谢产物4-羟基环磷酰胺(4-hydroxycyclophoplaamide，4-OH CPA)，后者进入细胞核内进一步分解为有治疗效果的磷酰胺氮芥、无治疗效果的丙烯醛；CPA也可经另一条代谢通路产生氯乙醛和其它中间产物。CPA及其代谢产物最后在GSTs催化下，结合GSH排出体外。 大量的研究表明，对CPA催化活性最高的P450酶是CYP286、2C19和3A4，这些酶代谢活性的改变是导致CPA体内代谢巨大个体差异的主要原因。然而，CYP3A4没有明显的基因多态性，仅在启动子区域发现19种极低发生频率的单核苷酸突变，中国人群中存在CYP3A4<'*>4、CYP3A4<'*>5、CYP3A4<'*>6，但三种突变发生率总和不超过5﹪，因此不足以解释中国人群中CPA代谢巨大的个体差异。而较早前的研究显示CYP286和2C19的突变率较高，CYP286在德国高加索人群中的突变率约50﹪，CYP2C19在中国汉族健康人群中突变率超过40﹪。这些基因突变引起的酶活性的改变可能与CPA代谢的个体差异相关。如有研究发现携带杂合型或纯合型CYP2C19<'*>2的狼疮肾病病人用CPA冲击治疗后出现未成熟卵巢功能不全的风险低于野生型病人。在生存分析方面携带纯合型CYP286<'*>5或纯合型CYP2C19<'*>2病人到达终末肾病和双倍肌酐的机率高于野生型或杂合型病人，而获得完全肾功能缓解机率低于野生或杂合型病人。由于CPA及其代谢产物最后在GSTS催化下结合GSH排出体外，所以GSTs对CPA及其代谢产物的解毒具有非常重要的作用。GSTs也具有基因多态性，本实验组较早前的研究显示其中一个亚型-GSTP1的基因多态性对CPA代谢产物的排出影响较大。综上所述，CYP286、2C19和GSTP1在CPA的代谢过程中起重要作用，其基因多态性可能与CPA疗效和不良反应的个体差异有关。而且，这些参与代谢CPA的基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)存在连锁不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)现象，能够形成不同的单倍型(Haplotype)，这些单倍型的多态性也可能是引起CPA疗效和不良反应个体差异的原因之一。 细胞色素P450 286(Cytochrom P450 286，CYP286)是一种重要的CYP450酶系，也是CPA代谢途径中起主要催化作用的酶，其基因型在健康人群中的分布是研究该基因与活性关系的基础，也是研究其与药物疗效和不良反应关系的基础。CYP286占肝脏中CYP450酶总含量的3～5﹪，参与3﹪左右临床常用治疗药物的催化代谢。CYP286的蛋白表达以及酶活性有着广泛的个体差异及种族差异，导致这些差异的原因可能足环境因素和CYP286基因的多态性。然而，由于缺乏特异性的探针药，到目前为止，CYP286的体内酶活性还很难评价。 人类CYP286的表达受单基因调控，到目前为止，已经有一系列CYP286的单核苷酸多态性(SNPs)被报道，其中某些SNP位点可以导致蛋白质一级结构的改变，包括64C>T(exon1)，516G>T(exon4)，777C>A(exon5)，785A>G(exon5)和1459C>T(exon9)。对体外样本基因型与表型相关性的分析显示，位于9号外显子上的点突变1459C>T可以降低CYP286的蛋白表达和酶活性，而由5号外显子上785A>G编码的蛋白活性却比野生型高，4号外显子上的516G>T也使编码的CYP286蛋白活性增高。这些基因突变引起的酶活性的改变可能使经CYP286代谢的药物体内的处置过程也发生改变，从而产生了疗效和毒副反应的个体和种族差异。 种族差异是导致药物代谢、疗效和不良反应个体差异的重要因素。许多重要的CYP450，包括CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6的SNPs都使酶活性产生了巨大的种族差异，从而影响了相应药物在不同种族中的治疗效果。尽管已有人研究了CYP286在高加索人，非洲人，日本人及韩国人中的基因多态性，但在中国人群中的多态性研究仍是空白。我国是一个多民族国家，由于历史和地域的差别，不同民族中CYP286的基因型不同，导致酶活性的差别。 本研究以人群为基础，用PCR-RFLP技术分析汉族和维吾尔族CYP286的基因型频率在这些群体及地区中的分布情况；用LC/MS/MS的方法检测CPA及其活性代谢物4-OH CPA的血药浓度；在此基础上，采用病例一对照研究的方法，结合基因型与血药浓度测定，并分析SNPs形成的单倍型的多态性，对SLE病人CYP286、2C19、GSTP1基因型及单倍型与使用CPA治疗后疗效与不良反应的相关性进行研究，以期探讨CYP286、2C19、GSTP1基因多态性对CPA短期疗效和短期不良反应的影响，旨在提高CPA的疗效，降低毒副反应，为制定合理的CPA治疗方案提供理论指导。 第一部分 细胞色素P450 286基因型研究 目的：研究健康汉族人和维吾尔族人CYP286的基因多态性分布，并与其他种族进行比较，明确种族差异。 方法：用PCR-RFLP的方法检测分析CYP286五个非同义点突变-C64T, G516T，C777A,A785G以及C1459T在健康中国汉族人及维吾尔族人中的分布情况。计算各民族基因型频率，并验证是否符合Hardy-Weinberg平衡。用x<'2>检验汉族、维吾尔族及已报道的其他种族基因突变频率与有关等位基因频率的差别。 结论：维吾尔族人与汉族人CYP286的突变基因型频率存在明显的种族差异。维吾尔族人CYP286的基因型频率介于汉族与高加索人之间，更接近高加索人，这与维吾尔族人起源于高加索人相一致。 第二部分 血浆中环磷酰胺及其代谢物4-羟基环磷酰胺的LC/MS/MS分析方法的建立 目的：建立灵敏度和特异性较高的LC/MS/MS方法检测血浆中环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺的浓度，并进行验证，为下一部分SLE病人体内环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺的血药浓度的测定奠定基础。 方法：建立环磷酰胺及其代谢物4-羟基环磷酰胺检测的质谱方法、液相方法及血浆样本的衍生化和萃取方法。进行全面的方法学验证：包括方法的精密度、准确度、线性及最低检测限、稳定性及基质效应等。 结论：建立了LC/MS/MS方法检测人血浆中环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺浓度，方法精密度、准确度好，灵敏度高，适用于人体药动学研究。 第三部分 细胞色素P450 286、2C19，谷胱甘肽硫转移酶P1的基因型与环磷酰胺在系统性红斑狼疮病人中疗效与不良反应相关性的研究 目的：研究CYP286，2C19和GSTP1基因型对CPA治疗病人疗效与不良反应的影响，为提高CPA疗效，降低毒副反应，制定合理的CPA治疗方案提供理论指导。 方法：用PCR-RFLP的方法检测CYP286，2C19和GSTP1的基因多态性，用LC/MS/MS的方法检测环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺的血药浓度。采用病例一对照的研究方法分析SLE病人CYP286，2C19和GSTP1基因型，环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺的血药浓度与使用CPA治疗后的疗效和不良反应的相关性。 结论：CYP286<'*>9突变型病人的疗效较好，在<30岁的病人中尤其如此；CYP2C19<'*>2野生型病人容易发生骨髓抑制和感染；GSTP1突变型的的病人也易出现骨髓抑制；对于携带这些基因型的SLE病人可适当减少CPA的给药剂量。 第四部分 细胞色素P450 286、2C19，谷胱甘肽硫转移酶P1的单倍型与环磷酰胺在系统性红斑狼疮病人中疗效与不良反应相关性的研究 目的：研究SLE病人中CYP286，2C19和GSTP1的单倍型组成，探索这些单倍型对CPA治疗SLE病人疗效与不良反应的影响，为提高CPA疗效，降低毒副作用，制定合理的CPA个体化用药方案提供理论指导。 方法：用PHASE V.2.1软件进行单倍型分析，用LC/MS/MS的方法检测环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺的血药浓度。采用病例一对照的研究方法分析SLE病人CYP286，2C19和GSTP1单倍型，环磷酰胺及4-羟基环磷酰胺的血药浓度与使用CPA治疗后的疗效和不良反应的相关性。 结论：携带单倍型011000的病人疗效较好，同时也易出现骨髓抑制；携带单倍型011101的病人疗效也较好，但容易发生胃肠道反应。对于携带这两种单倍型的SLE病人可适当减少CPA的用量。