目的:对重组Arg³⁴-GLP-1[7-37]生产制备过程中的潜在杂质进行分离纯化和结构确证。方法:将发酵后的料液进行高效液相色谱分析检测,利用离子交换色谱和制备液相纯化得到Arg³⁴-GLP-1[7-37]纯品和杂质组分,将纯品进行高温、酸碱等不同条件下的破坏实验,来探知杂质产生机理,利用LC-MS、MALDI-TOF质谱、蛋白质全序列测序等方式推断杂质的分子量与结构。结果:经阴离子交换色谱及反相制备纯化后,Arg³⁴-GLP-1[7-37]的纯度可达97.9%,杂质组分经LC-MS解析得到6个单体组分的分子量,分别为1033.1500,1302.8308,2743.9113,3381.4459,2488.5400,3108.8330,推测其可能结构序列。反相制备分离出三种主要杂质并将其纯化至91.4%、99.2%和96.7%。通过MALDI-TOF测得其[M+H]⁺分子量分别为1033.5446,2744.2397和3112.4475,根据Arg³⁴-GLP-1[7-37]的氨基酸序列来推断杂质1,杂质3与杂质9可能序列为E-F-I-A-W-L-V-R,H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W,H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L-V-R。将纯化前后的成分进行比对,表明上述3个主要杂质是由发酵过程产生,通过极端条件处理这些杂质含量会显著增加。本研究对于三个杂质的结构解析及机理探究均为首次发表。结论:制备得到的3个杂质均为Arg³⁴-GLP-1[7-37]在高温、碱性及氧化条件下的降解片段,为防止纯化过程中主产物降解,应控制温度不宜太高,避免过酸过碱及一些易被氧化的条件。本文为GLP-1及其类似物的研究指出了一些应避免的误区。